浅谈CRISPR/Cas9技术在基因工程中的应用

吴红玉

2014年11月28日，全球权威科学杂志《Science》在线发表综述文章，描述了CRISPR/Cas9系统的发展历史并肯定其应用.众所周知，生物的遗传信息储存在基因中，特定的编码基因决定特定的蛋白质.当基因发生突变的时候，由其编码的蛋白质的氨基酸组成以及三维构象往往会同样发生改变，有些蛋白甚至提前终止，从而导致遗传疾病的发生.因此，对于基因组做出特异性的靶点修饰，是治疗人类遗传疾病的可行方法.通过对遗传学的位点修饰的探究，科学家们在细菌和古细菌中找到了一种新的RNA，该RNA起着地址标记的指导作用，被命名为gRNA.gRNA和CRISPR/Cas9蛋白相互作用，确保切割发生在基因组的确切位置.通过科学工作者的合作和研究，CRISPR/Cas9系统被不断的简化使其变成现在的通用技术.

一、CRISPR的发展历程

1985年，日本大阪大学学者发表碱性磷酸酶基因的研究性篇论文，该发现涉及编码基因附近存在的小的DNA片段.之后有三个独立的生物信息学团队作出报告，他们的研究均暗示CRISPR在微生物免疫中有可能发挥了作用，他们在报告中指出了间隔区DNA与噬菌体的基因序列通常高度匹配.2007年，科学家通过研究发现，添加或删除和噬菌体DNA相匹配的间隔区DNA会改变嗜热链球菌对噬菌体攻击的抵抗力，这是对间隔区DNA功能的巨大突破.2011年科研工作者开始尝试解析各种与CRISPR相关的蛋白质的功能，最终分离出了Cas9蛋白质的CRISPR系统，这一发现为研究间隔区DNA如何在细菌的免疫防御中发挥了关键作用.2013年初，《Science》杂志公布了两项最新研究成果，首次证明了Cas9 核酸酶可以对小鼠和人类细胞进行有效的编辑，是更为安全的哺乳动物细胞基因组编辑的新方法.如今，科研工作者能够通过设计gRNA，靶向包括果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠和人类等在内的许多物种的基因组中的几乎任何碱基序列，实现真正的基因工程的遗传编辑.

CRISPR系统从初发现到2013年的系统建立实现了在多个物种中的应用，并将在更多的物种中得到应用.

二、CRISPR的工作原理

虽然科学家到目前为止还没有完成弄清楚CRISPR-Cas/Cas9 系统的详细作用机制， 但已基本明确了该系统的作用过程.目前大家比较公认的该系统的作用机制大体可分为以下3个不同的阶段，如图2.

噬菌体侵入宿主时，首先产生编码蛋白，这个过程由Cas/Cas9基因完成.编码蛋白产生后靶向调节间隔序列.此后，基因组中被靶向的间隔序列被剪切，整合到宿主基因组的5′端.短的参入间隔序列被转录为crRNAs.最后，在CAS蛋白复合物的参与下，靶向干扰噬菌体的基因组序列.

三、Cas9的应用优势

虽然CRISPR/Cas9被发现的历史并不长，但其在工业和学术领域方面的应用已经非常的广泛.

首先，CRISPR/Cas9的特性被用于不同菌株分类.由于Cas9蛋白的来源是细菌来源，所以要使得Cas9蛋白在不同动物细胞核内高效转运，需要在蛋白上添加真核细胞的核定位序列.科学家通过改造Cas9使得多系统都能够进行CRISPR/Cas9应用.

此外，相比于遗传学中常用的ZFN和TALEN两种人工核酸酶，CRISPR/Cas9凭借其可以造成特异性的单链切口，激活细胞的同源重组机制的特点因而具有极大的优势.同时，对CRISPR/Cas9进行多个位点修饰方法，实现大片段缺失的突变改造机制.这就为困扰人类多年的遗传疾病的治疗带来了一线曙光.通过科学家的努力，CRISPR/Cas9系统已经能够精确编辑小鼠和大鼠基因组特定的基因位点，目前已经成功应用于大小鼠基因的敲除和过表达的模型制备.Cas9在科研工作中的突破性贡献，为无数科学工作者提供了敲除的平台以便更好的研究.

教科书上已经对1997年体细胞克隆多利羊的报道做出了“突破性进展”的评述.然而转基因动植物由于技术和舆论压力仍然不为所有人接受.而如果充分利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术，则有可能使这一局面得到改观.比如有科研小组利用CRISPR/Cas9系统定点修饰猪等家畜的基因组，通过CRISPR/Cas9修饰影响家畜生产的基因单核苷酸多态性，从而可以提高猪肉瘦肉率、绵羊肌肉含量等.此外，CRISPR/Cas9在干细胞研究中也有着应用.

四、Cas9获得的荣誉

新技术CRISPR/Cas9，被称为“DNA 剪刀”或“基因剪刀”.这项科研的重要意义在于可以为人类的健康谋福祉.自 2012年6月首度亮相之后，获得了许多科学家的认可，在数个国际会议上备受推崇，为基因治疗和遗传疾病的研究拓展了思路，提供了全新的治疗策略.众所周知，人类有许多疾病，例如镰刀型细胞贫血症、糖尿病、爱滋病、抑郁症等，都与基因有关.人们广泛利用 Cas9技术，从基因的源头上探究这些疾病发病的根源，尝试找出新的标靶药物，达到治愈疾病的目的.新技术CRISPR/Cas9甚至还可以应用于改造酵母菌，让其来生产生物燃料，从而缓解人类的能源危机；应用于改造小麦，使其能抵抗害虫和干旱天气，缓解人类的粮食危机.美国著名教授 Jonathan Weissman 称：“ CRISPR/Cas9技术彻底改变游戏规则，现在我们可随意启动或关闭遗传因子.”

五、展望

回首生物学的发展进程，能够真正推进人类科学的研究皆基于探究自然科学的奥秘.CRISPR/Cas9的发现为DNA提供了安全可行的基因剪刀，避免人们因为外源基因导入或不正当基因编辑而引起恐慌.随着CRISPR/Cas9系统的完善建立，该技术将越发普及，用于解决人类面临的疾病，食物安全等问题，为科研事业的推进提供了巨大的平台.