超高效液相色谱泊联质谱同时测定首乌藤中13种成分

罗益远 刘娟秀 王锋 刘训红 王胜男 华愉教 兰才武

[摘要]建立超高效液相色谱串联质谱法（UPLCMS/MS）同时测定首乌藤中二苯乙烯（二苯乙烯苷、虎杖苷、白藜芦醇）、蒽醌（大黄素、大黄素甲醚、大黄素8βD葡萄糖苷、芦荟大黄素）、黄酮（表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素）及酚酸（没食子酸）等13种成分的方法。采用Waters BEH C18（21 mm×100 mm，17 μm）色谱柱，流动相为水（含01%甲酸）乙腈，梯度洗脱，柱温35 ℃，流速025 mL·min-1，采用电喷雾离子源（ESI），多反应离子监测（MRM）扫描方式进行检测。采用TOPSIS法对13种成分进行分析评价。结果13种成分在一定浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数大于0991 5，精密度、重复性和稳定性良好；加样回收率在9524%～1023%，RSD均小于5%。TOPSIS分析显示广州产的样品综合质量较好。所建立的方法准确、专属性、重复性较好，可用于首乌藤中多元功效物质或指标成分的同时测定，为首乌藤药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考。

[关键词]首乌藤；UPLCMS/MS；二苯乙烯类；蒽醌；黄酮；酚酸；同时测定

[Abstract]A comprehensive analytical method based on UPLCMS/MS was developed for the simultaneous determination of thirteen components including three stilbenes （stilbeneglucoside， polydatin， resveratrol）， four anthraquinones （emodin， physcion， emodin8βDglucopyranoside， aloeemodin）， five flavonoids （epicatechin， rutin， hyperoside， astragalin，quercetin） and one phenolic acid （gallic acid） in Polygoni Multifori CaulisThe separation was carried out on a Waters BEH C18 column（21 mm×100 mm，17 μm）with gradient elution of acetonitrilewater （01% acetic acid） at a flow rate of 025 mL·min-1， and column temperature was 35 ℃ The target compounds were analyzed by multiple reaction monitoring （MRM） mode TOPSIS analysis ware performed to evaluate the samples from different areas and commercial herbs according to the contents of thirteen components The correlation coefficients of all the calibration curves were higher than 0991 5 The average recoveries ranged from 9524% to 1023%， and the relative standard deviations were less than 5% The result of TOPSIS analysis showed that the comprehensive quality of Polygoni Multifori Caulis sample from Guangzhou was better The developed method with good repeatability and accuracy was suitable for the simultaneous determination of multiple functional substances， which provided a new basis for the comprehensive assessment and overall control of the quality of Polygoni Multifori Caulis

[Key words]Polygoni Multifori Caulis； UPLCMS/MS； stilbenes； anthraquinones； flavonoids； phenolic acids； simultaneous determination

doi：10.4268/cjcmm20160818

首乌藤为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb的干燥藤茎，具有养血安神、祛风通络的功效，临床用于治疗失眠多梦、血虚身痛、风湿痹痛、皮肤瘙痒[1]，已被列入卫生部公布的可用于保健食品的物品名单，其改善睡眠的主要有效成分为蒽醌类、黄酮类[23]。《中国药典》2015年版一部首乌藤质量标准只规定了2，3，5，4′四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷的含量测定，而某些以首乌藤为主药的复方制剂（如首珍颗粒、加味安尔眠颗粒等）则以蒽醌类成分为质控指标[45]。为确保以首乌藤为主药的复方制剂的成品质量，需建立首乌藤中多元功效物质含量测定的方法，以全面控制首乌藤原药材的内在质量。本实验在前期研究基础上[69]，采用超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）联用技术同时测定首乌藤药材中二苯乙烯（二苯乙烯苷、虎杖苷和白藜芦醇）、蒽醌（芦荟大黄素、大黄素8βD吡喃葡萄糖苷、大黄素和大黄素甲醚）、黄酮（表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷和槲皮素）和酚酸（没食子酸）等13种成分的含量，结合TOPSIS分析[1013]，对首乌藤不同产地或商品药材进行综合评价，为首乌藤药材的内在质量的综合评价和全面控制提供科学依据。

1材料

超高效液相色谱TQD 质谱联用仪，Acquity系统，Masslynx V41 工作站（美国Waters公司产品）；KQ500B超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司，超声功率500 W，40 kHz）；BSA2245型电子分析天平（1/10万，德国赛多利斯公司）；ME36S型电子分析天平（1/100万，德国赛多利斯公司）。高速离心机（H1650W，湖南湘仪实验仪器开发有限公司）。

对照品二苯乙烯苷（批号110844200607）、大黄素（批号110756200110）、芦荟大黄素（批号07959803）、大黄素甲醚（批号0758200206）、表儿茶素（批号10878200102）、没食子酸（批号110831200302）、槲皮素（批号100081200907）、芦丁（批号00809705）、金丝桃苷（批号111521200303）、槲皮素（批号100081200406）、紫云英苷（批号11092001）购自中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%；虎杖苷（批号YY90052）、白藜芦醇（批号YY90051）、大黄素8βD葡萄糖苷（批号YY90555）购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98%。水为超纯水（由Millipore纯水器制备），乙腈、甲醇（色谱纯，德国Merk公司），甲酸（色谱纯，美国ROE公司），其余试剂均为分析纯。

首乌藤药材样品均为实地采集或由相关医疗单位提供，编号及来源如下：S1采自南京中医药大学药苑、S2采自江苏省句容马山、S3四川产，由江苏省中医院提供（批号131209）、S4湖北产，由南京大华中药店提供（批号130901）、S5湖北产，由南京益大药店提供（批号130614）、S6广东产，由北京同仁堂南京店提供（批号130513046）。所有样品均经南京中医药大学药学院刘训红教授鉴定为何首乌P multiflorum的藤茎。留样凭证保存于南京中医药大学中药鉴定实验室。

2方法与结果

21色谱条件

色谱柱Waters BEH C18（21 mm×100 mm，17 μm）；流动相水（含01%甲酸，A）乙腈（B）；梯度洗脱0～1 min，10% B；1～2 min，10%～90% B；2～3min，90% B；3～4 min，90%～10% B；4～5 min，10% B。柱温35 ℃，流速025 mL·min-1，进样量5 μL。

22质谱条件

离子化方式：电喷雾离子化（ESI），多反应监测离子扫描模式（MRM）测定，主要质谱参数为：脱溶剂温度为400 ℃，锥孔气体积流量为50 L·h-1，正离子模式下毛细管电压为 35 kV，脱溶剂气体积流量为 800 L·h-1；负离子模式下毛细管电压25 kV，脱溶剂气体积流量为550 L·h-1。13种成分的质谱具体参数见表1。

23对照品溶液制备

精密称取表儿茶素642 mg、芦丁211 mg、金丝桃苷150 mg、二苯乙烯苷213 mg、紫云英苷178 mg、白藜芦醇263 mg、槲皮素155 mg、没食子酸549 mg、芦荟大黄素027 mg、大黄素8βD葡萄糖苷2520 mg、大黄素1485 mg、虎杖苷

238 mg、大黄素甲醚1460 mg对照品，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。取各对照品母液适量，加甲醇配制成含上述对照品的混合储备液，并逐级稀释，得到一系列不同浓度的混合对照品溶液，4℃保存，备用。

24供试品溶液制备

取干燥恒重样品粉碎过80目筛，精密称取样品粉末10 g，平行称取2份，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，称重，室温下超声提取45 min后取出，放冷以70%甲醇补足失重，静置冷却，保存于4 ℃。测定时精密吸取1mL，置于100 mL量瓶中，用初始流动相乙腈01%甲酸 1∶9定容至刻度，摇匀，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液经022 μm的微孔滤膜滤过，即得。

25线性关系、检测限和定量限

精密吸取23项下混合对品照标溶液，置于10 mL量瓶中，用初始流动相乙腈01%甲酸水1∶9逐级稀释制成一系列浓度的混合对照品溶液，按上述色谱质谱条件进样分析，以对照品的峰面积（Y）对相应的浓度（X）进行线性回归，得回归方程、相关系数和线性范围。以各化合的信噪比（S/N）等于3时相对应的浓度确定为最低检测限（LOD），以各化合的信噪比（S/N）等于10时相对应的浓度确定为最低定量限（LOQ）。结果见表2， 图1。

26方法学考察

精密度、重复性、稳定性试验精密吸取同一混合对照溶液分别重复进样6次，分别计算13种成分的峰面积的RSD；取同一样品，按照样品制备方法制备供试品溶液，进样，重复测定6次，计算各成分的

含量的RSD；取同一样品制备供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h测定13种成分的含量并计算其RSD，结果见表3。

加样回收率试验取已知含量的样品05 g（6份），精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入一定量各对照品溶液，根据24项下方法制备加样回收率供试品溶液，根据样品测定方法进样，计算各成分的平均回收率及RSD，结果见表3。

27样品测定

取24项下各首乌藤供试品溶液，按照上述色谱质谱条件测定，根据相应线性关系计算供试样品中13种成分的含量，测定结果见表4。

28Topsis分析

以各成分含量为分析指标，采用Topsis分析方法对首乌藤药材中13种目标成分进行综合分析评价，得出排序结果。

281归一化处理将首乌藤药材中13种目标成分的含量数据矩阵进行归一化处理，建立相应矩阵，归一化处理后的矩阵见表4。

αijXij/∑ni=1X2ij（原高优指标）

X′ij/∑ni=1（X′ij）2（原低优指标）

注：式中Xij表示第i个评价对象在第j个指标上的取值。X′ij表示经倒数转换后的第i个评价对象在第j个指标上的取值，αij表示第i个评价指标在第j个评价指标上归一化处理后的取值。

282最优方案与最劣方案根据归一化处理后的矩阵得到最优值和最劣值向量，即有限方案中的最优方案（A+）与最劣方案（A-）

A+=（0548， 0536， 0416， 0488， 0593， 0612， 0495， 0655， 0631， 0539， 0998， 0877， 0800）

A-=（0256， 0179， 0396， 0373， 0216， 0153， 0322， 0095， 0241， 0352， 0005， 0080， 0096）

283Di+与Di-的计算分别计算各评价对象与最优方案及最劣方案的距离Di+与Di-

D+i∑10j=1（α+ij-αij）2

D-i∑10j=1（α-ij-αij）2

式中D+i与D-i分别表示第i个评价指标与最优方案及最劣方案的距离；αij表示某个评价对象i在第j个指标的取值。

284Ci的计算计算各评价对象与最优方案的接近程度。

Ci=D-iD+i+D-i

285Topsis分析方法按照Ci大小将各评价对象排序，Ci越大，表示综合质量越好。首乌藤药材的Topsis评价结果见表5。

3讨论

31色谱条件的优化

实验考察了甲醇水、乙腈水、甲醇01%甲酸水、乙腈01%甲酸水等溶剂作为流动相，结果发现

采用乙腈作为流动相时的分离效果明显优于甲醇，在流动相中加入一定比例的甲酸可增强样品中待测物的保留，并减少色谱峰拖尾，从而提高分析方法的分离效果和灵敏度。因此本实验采用乙腈01%甲酸水作为流动相梯度洗脱。

32质谱条件的优化

实验同时选用正负2种离子模式测定13种目标成分的含量，其中二苯乙烯苷、白藜芦醇选择负离子模式，经过反复试验考察，发现这几种成分具有较好的稳定性，具有较高的响应值和更好的峰形。其他成分选择正离子模式，也均能使各成分在检测条件下更稳定，峰形及响应值更佳。

33供试品制备方法的优化

实验中对提取溶剂（60%，70%，80%，90%，100%甲醇）、料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35）及提取时间（15，30，45，60 min）进行了考察。结果表明，70%甲醇作为最适合的溶剂可以提取出更多待测物；以料液比1∶25，超声提取45 min具有较好的提取效率。因此选择以70%甲醇作为溶剂，料液比1∶25、超声提取45 min。

34结果分析

测定结果表明，首乌藤药材的13种指标成分中，以二苯乙烯苷和大黄素8βD吡喃葡萄糖苷的含量较高，其次为大黄素甲醚、大黄素及虎杖苷，这5种成分的总量达179%以上；不同产地及商品药材中13种成分的含量有所差异，二苯乙烯苷、虎杖苷及没食子酸的含量以广州产样品（S6）较高，所测4种蒽醌的总量、5种黄酮的总量以四川产样品（S3）较高；所分析的首乌藤样品中，其二苯乙烯苷含量均符合《中国药典》2015年版一部的标准，仅单一成分为评价指标难以反映药材的整体质量，测定多元指标成分的含量对中药材的质量控制更为全面。由于首乌藤不同产地及商品药材中多元指标成分含量不一，难以直观评价，因而用TOPSIS分析法进行综合评价，以克服了人为确定权重系数的片面性及主观性，从而提高分析方法的可靠性。综合评价结果显示，广州产首乌藤样品（S6）的综合质量较好。

本实验建立了超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）技术同时测定首乌藤中二苯乙烯苷、虎杖苷、白藜芦醇、芦荟大黄素、大黄素8βD吡喃葡萄糖苷、大黄素、大黄素甲醚、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、没食子酸含量的方法，并对不同产地或商品药材进行TOPSIS综合评价，可为首乌藤药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考。

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[责任编辑丁广治]