微透析- HPLC测定甘草次酸对雄黄染毒小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的影响

方　莹，张颖花，霍韬光，何　俏，侯明山，姜　泓*，康廷国*

(1. 辽宁中医药大学 药学院, 辽宁 大连 116600;　2. 中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110122)



微透析- HPLC测定甘草次酸对雄黄染毒小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的影响

方莹1，张颖花2，霍韬光2，何俏2，侯明山2，姜泓2*，康廷国1*

(1. 辽宁中医药大学 药学院, 辽宁 大连 116600;2. 中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110122)

摘要：建立微透析-HPLC测定小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的方法，探讨甘草次酸对雄黄染毒小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的影响. 结果表明，所建方法准确、可靠，具有连续活体取样、实时动态检测的优势. 此外，甘草次酸对雄黄引起的小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的降低有保护作用.

关键词：微透析；高效液相色谱法；半胱氨酸；同型半胱氨酸；雄黄；甘草次酸

雄黄为含砷矿物药，临床上因未科学(长期、超量和不规范)合理使用单味雄黄或牛黄解毒片引起不良反应或慢性砷中毒事件时有报道[1]. 动物实验研究表明，雄黄中砷可进入血中[2-3]，通过血脑屏障产生神经系统毒性[4-6]，且易与含巯基分子结合[7]. 半胱氨酸(cysteine, Cys)和同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)结构中均含有巯基，且与谷胱甘肽合成有关. 海马是学习记忆的关键脑区，有关雄黄对海马细胞外液内Cys和Hcy水平的影响未见报道. 在中药制剂中，雄黄常与甘草配伍使用，甘草次酸是甘草主要药效成分的代谢产物[8]，甘草次酸是否对雄黄染毒小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的变化有保护作用，未见报道.

微透析系统具有连续活体取样、实时动态检测的优势[9]，而高效液相色谱法(HPLC)可以将Cys和Hcy很好的从基质中分离并进行检测，故本实验将建立微透析-HPLC测定小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy的含量，探讨雄黄对小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy水平影响及甘草次酸的保护作用，为慢性砷中毒防治及雄黄与甘草配伍机制的研究提供理论依据和研究思路.

1实验部分

1.1仪器与试剂

1.1.1药品与试剂

雄黄(产地甘肃，含AS4S4>90%)；甘草次酸(上海源叶生物有限公司)；羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)；半胱氨酸和同型半胱氨酸(美国Aladdin工业公司)；7-氟苯呋咱-4-硫酸铵盐(7-fluorobenzofurazan-4-sulfonic acid ammonium salt，SBD-F)(美国Sigma公司)；林格试液(四川科伦药业股份有限公司)；甲醇为色谱纯试剂(山东禹王集团)；其他试剂均为市售分析纯.

1.1.2主要仪器

1260型高效液相色谱仪(包括G1312C二元泵、G1314F紫外检测器，美国Agilent公司)；单臂脑立体定位仪68012(瑞典瑞沃德公司)；微透析系统(瑞典CMA公司)；MVS-1漩涡混悬器(北京金北德工贸有限公司)；3K-18超速冷冻离心机(日本日立公司)；PH-3c型酸度计(上海精密科学实业有限公司)；ER-182A全自动电子天平(十万分之一)(日本A&D公司)；XW-80A漩涡混合器(上海精科实业有限公司)；Easypure纯水系统(美国Barnstead公司).

1.2实验方法

1.2.1动物分组、染毒及透析液样品采集

SPF级健康ICR 雄性小鼠70只，体质量(22±3)g，由中国医科大学实验动物部提供. 采用标准饲料喂养于室温(24±1)℃，相对湿度为(50±5)%环境中，保证光照12 h/d，昼夜循环喂养，小鼠可自由摄食摄水. 实验前适应性饲养小鼠1 w，按体质量随机分成7组，每组10只. 分为对照组、雄黄低、中、高剂量组(0.15 g/kg、0.45 g/kg、1.35 g/kg雄黄)、甘草次酸对照组(48 mg/kg甘草次酸)、甘草次酸干预低、高剂量组(1.35 g/kg雄黄+16 mg/kg甘草次酸、1.35 g/kg雄黄+48 mg/kg甘草次酸)，以 0.5% CMC-Na为混悬介质，灌胃给药、每日灌胃 1 次，连续8 w. 每3 d称重1 次，调整灌胃容量.

于末次给药24 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，将其固定在脑立体定位仪上. 切开头部皮肤，暴露脑前后囟，参照小鼠脑立体定位图谱定位、透析，以2 μL/min的流速向探针内恒速灌入林格试液，待平衡40 min后开始收集样本，共收集60 min，透析液在-70 ℃冰箱保存，待用.

1.2.2探针体外回收率测定

每次透析前将探针插入Cys和Hcy浓度分别为5、10 μmol/L混合标准品中，以2 μL/min的流速平衡40 min后，每30 min收集一次透析液，共收集60 min. 测定透析液中Cys和Hcy浓度，计算探针体外回收率.

1.2.3样品处理

精密吸取1.2.1项下透析液30 μL，加入0.312 5 g/L SBD-F工作液30 μL，混悬5 s，于60 ℃的水浴中反应1 h. 冷却至室温，取20 μL进样.

1.2.4色谱条件[10]

HPLC采用Thermo ODS色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH=4.5)等度洗脱(体积比 3.5∶96.5)；流速：0.8 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：254 nm；进样体积：20 μL.

1.3方法学考察

1.3.1标准曲线与检测限

将Cys和Hcy标准品储备液分别用林格试液稀释制成一系列标准溶液，按“1.2.3”项下方法预处理后测定，以各个标准物质的浓度为横坐标X，其对应色谱峰面积值为纵坐标Y，用最小二乘法进行回归计算，绘制标准曲线. 以S/N=3计算检测限.

1.3.2精密度与准确度

分别取对照组小鼠混合海马透析液，加入等体积的Cys(2、5、10 μmol/L)和Hcy(10、20、50 μmol/L)标准品溶液，制得质控样品，分别制备6个平行样品，重复3个分析批，连续测得3 d，并与标准曲线同批测得，以当日的标准曲线计算质控样品的测得浓度，扣除本底值后与配制的浓度对照，求得方法的精密度与准确度.

1.3.3加标回收率

取质控样品，每一浓度制备3个平行样品，同法测定，以当日的标准曲线计算质控样品的测得浓度，计算加标回收率，加标回收率=(测得浓度-本底值)/加入标准品浓度.

1.4透析液中Cys和Hcy含量的测定

精密量取海马透析液，按“1.2.3”项下方法，按上述色谱条件分别测定70只小鼠海马透析液中Cys和Hcy含量.

1.5统计分析

所得数据以平均值±标准差表示，用SPSS 17.0软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行各指标组间差异的显著性检验，以P<0.05作为检验的显著性差异.

2结果与讨论

2.1色谱行为

在上述色谱条件下，空白对照、Cys和Hcy的混合标准品、海马透析液的色谱图见图1. 透析液中Cys和Hcy在10 min内实现了完全分离，内源性物质和所使用的试剂不干扰Cys和Hcy的测定. Cys和Hcy的保留时间分别为5. 0和6.4 min.

1.Cys　2.Hcy图1　空白对照(A) 、混合标准品(B，透析液+10 μmol/L Cys和20 μmol/L Hcy标准品)和透析液样品(C)的HPLC色谱图 Fig.1　Chromatogram of the blank(A), mixed standard solution(B, dialysis fluid+10 μmol/L Cys and 20 μmol/L Hcy standard) and dialysis fluid samples (C)

2.2方法学考察

2.2.1标准曲线、检测限及体外探针回收率

结果表明，Cys在0.5～20 μmol/L范围内线性关系良好，Y=0.190 0X+0.960 6(r=0.998 6)；Hcy在1～50 μmol/L范围内线性关系良好，Y=0.506 2X+7.934 5(r=0.997 5)；Cys和Hcy的最低检测浓度分别为0.2和0.1 μmol/L；平均体外探针回收率分别为21.11%和39.20%.

2.2.2精密度、准确度及加标回收率

由表1可见，Cys 和Hcy的日内、日间精密度分别在1.5%～9.2%和1.1%～5.0%之间；准确度分别在-5.5%～-3.6%和-6.5%～-1.2%范围内；Cys、Hcy的加标回收率分别在82.0%～105.7%和84.8%～99.9%之间. 表明测定海马透析液中Cys和Hcy的分析方法精密度、准确度及回收率良好.

2.3小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量

由表2可见，小鼠染毒8 w后，与对照组相比较，随着雄黄染毒剂量的升高，Cys含量在雄黄低剂量组变化不明显(P>0.05)，而在中剂量组Cys含量升高36%(P<0.05)，高剂量组则降低27%(P<0.05)，呈现出先升高后降低的趋势；Hcy含量在雄黄低剂量组变化不明显(P>0.05)，而在中、高剂量组呈逐渐降低的趋势，分别降低36%、40%(P<0.05).

甘草次酸对照组与对照组的Cys和Hcy水平较接近，提示甘草次酸对小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy的水平没有影响. 与雄黄高剂量组相比，随着甘草次酸干预剂量升高，Cys和Hcy含量逐渐升高，但甘草次酸干预低剂量组Cys和Hcy水平没有明显变化(P>0.05)，甘草次酸干预高剂量组Cys含量升高36%(P<0.05)，Hcy含量升高101%(P<0.05)，并且与对照组水平接近，提示甘草次酸对雄黄所致小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的降低有拮抗作用.

表1　精密度、准确度及加标回收率(n=6)

表2　甘草次酸对雄黄染毒小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的影响 (μmol/L,x±s , n=10)

Table 2　Effect of glycyrrhetinic acid on Cys and Hcy of realgar-treated in the hippocampus extracellular fluid

of mice (μmol/L,x±s , n=10)

表2　甘草次酸对雄黄染毒小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的影响 (μmol/L,x±s , n=10)

名称对照组雄黄低剂量组雄黄中剂量组雄黄高剂量组甘草次酸对照组甘草次酸干预低剂量组甘草次酸干预高剂量组Cys8.28±1.458.83±1.2111.33±2.47*6.03±1.21*8.39±2.856.23±0.398.22±1.39#Hcy19.45±6.4413.53±5.6412.33±3.92*11.67±5.24*17.91±7.5816.44±8.8923.49±10.97#

注：*与对照组相比较，P<0.05；#与雄黄高剂量相比较，P<0.05.

2.4讨论

微透析技术是一种将灌流取样和透析技术结合起来的能对生物活体进行动态取样的技术，已成为实验神经生理学和神经化学的重要研究工具之一. 该技术具有活体连续取样、组织损伤轻、采样量小、基质效应低等特点，适合于进行HPLC分析. 故本实验建立了微透析-HPLC测定小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的方法. 方法学考察表明该方法具有较好的精密度、准确度及回收率，能有效、准确地检测海马细胞外液中Cys和Hcy水平. 透析结束，经过组织学验证，所有的探针均落在海马组织CA1区.

本研究对衍生化试剂SBD-F和3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(CNBF)的衍生化效果进行了比较，与CNBF相比，SBD-F有较高的灵敏度，并能通过HPLC实现Cys和Hcy的较好分离，故本实验选用SBD-F作为衍生化试剂. 由于Cys和Hcy保留时间较接近，对流动相比例进行了考察，结果与杨涛等[10]所用色谱条件一致. 对样品与衍生化试剂(SBD-F)用量在2∶1、1∶1、1∶2、1∶3范围进行优化，结果表明用量在1∶1与2∶1衍生化后色谱峰响应值较灵敏且响应值相当，所以本实验采用1∶1条件进行测定.

本研究表明，小鼠染毒8 w后，随着雄黄染毒剂量的升高，Cys含量呈现出先升高后降低的趋势，可能与低剂量砷引起机体内Cys水平代偿性增加有关，高剂量时Cys水平降低，可能与Cys与砷的结合有关，具体原因有待于进一步研究. 雄黄中、高剂量组可引起小鼠海马细胞外液中Hcy含量的降低，推测可能与雄黄中砷和Hcy结合有关. 甘草次酸对小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy水平没有影响，但有趣的是，当甘草次酸与雄黄联合使用时，表现出对雄黄引起的Cys和Hcy水平的降低有拮抗作用，并将Cys和Hcy水平调至接近对照组的水平，我们推测这可能与甘草的解毒、调和诸药的功效及中药配伍机制有关，具体机制有待于进一步探讨.

3结论

建立了微透析-HPLC测定小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy含量的方法，该法具有连续活体取样、实时动态检测的优势，方法准确、可靠、线性范围宽. 此外，甘草次酸对雄黄所致小鼠海马细胞外液中Cys和Hcy水平的降低有拮抗作用.

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[责任编辑：吴文鹏]

Effects of glycyrrhetinic acid on the levels of Cys and Hcy in realgar-treated mice hippocampal extracellular fluid determined by microdialysis-HPLC

FANG Ying1, ZHANG Yinghua2, HUO Taoguang2, HE Qiao2,

HOU Mingshan2, JIANG Hong2*, KANG Tingguo1*

(1.SchoolofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Dalian116600,Liaoning,China;

2.SchoolofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China)

Abstract:The method of micro-dialysis combined with HPLC was established for detecting the contents of cysteine and homocysteine in the hippocampal extracellular fluid of mice, that investigate the effects of glycyrrhetinic acid on the levels of Cys and Hcy in hippocampal extracellular fluid of realgar-treated mice. The results showed that the method was accurate, reliable, and had the advantages of continuous sampling in vivo and realtime dynamic analysis. In addition, glycyrrhetinic acid played a role of protection on the decreased levels of Cys and Hcy in hippocampal extracellular fluid of realgar-treated mice.

Keywords:microdialysis; HPLC; Cys; Hcy; realgar; glycyrrhetinic acid

文章编号：1008-1011(2016)02-0202-04

中图分类号：O657.7

文献标志码：A

作者简介：方莹(1991-)，女，硕士生，研究方向为中药品质评价及研究. *通讯联系人, E-mail：jianghong@mail.cmu.edu.cn, kangtg@lnutcm.edu.cn.

基金项目：国家自然科学基金(81473417；81403066)

收稿日期：2015-12-18.