高原红细胞增多症大鼠骨髓CD71+细胞EpoR表达、分布变化及意义

刘芳,冯婷婷，冀林华，韩园芳，丁谨

(1青海大学医学院，青海810000，2青海大学附属医院)

高原红细胞增多症大鼠骨髓CD71+细胞EpoR表达、分布变化及意义

刘芳1,冯婷婷2，冀林华2，韩园芳2，丁谨1

(1青海大学医学院，青海810000，2青海大学附属医院)

目的 观察高原红细胞增多症(HAPC)大鼠骨髓CD71+细胞促红细胞生成素受体(EpoR)表达及分布变化，并探讨其意义。方法 将48只雄性SD大鼠随机分为HAPC组和对照组，每组24只。HAPC组和对照组分别在海拔4 300、2 250 m自然环境下饲养。饲养40天行血液学参数[RBC、Hb、红细胞压积(HCT)、动脉血氧饱和度(SaO2)]和骨髓细胞分类计数检测，HAPC组RBC、Hb、HCT及红系细胞数量、中幼红细胞数量、晚幼红细胞数量均高于对照组，SaO2低于对照组(P均<0.05)，证实HAPC模型制备成功。两组均采用密度梯度离心法制备骨髓单个核细胞(MNC)悬液，CCK8法检测MNC增殖能力(以OD450表示)，单层半固体培养法检测红系集落形成单位(CFU-E)数量。采用免疫磁珠分选法从两组MNC悬液中分选CD71+细胞，免疫荧光法观察细胞膜表面EpoR荧光情况，ELISA法检测细胞膜和细胞质EpoR表达，Real-time PCR法和Western blotting法检测EpoR mRNA和蛋白相对表达量。结果 HAPC组和对照组OD450分别为1.54±0.04、1.17±0.05，CFU-E数量分别为(61.25±6.84)、(12.90±4.39)个；两组比较P均<0.01。免疫荧光显微镜下可见两组细胞膜表面均有环形或半环形的绿色荧光，但HAPC组细胞膜表面EpoR荧光强度和表达EpoR荧光的细胞数量均高于对照组。HAPC组及对照组CD71+细胞膜EpoR表达分别为2.41±0.03、1.55±0.06(P<0.05)；细胞质EpoR表达分别为96.39±0.42、94.49±0.65(P>0.05)。HAPC组CD71+细胞EpoR mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。结论 HAPC大鼠骨髓CD71+细胞EpoR表达升高，分布多集中于细胞膜表面；上述变化可能通过促进MNC及骨髓红系细胞增殖而参与HAPC的发生、发展。

高原红细胞增多症；CD71+细胞；促红细胞生成素受体；大鼠

高原红细胞增多症(HAPC)是一种常见的慢性高原疾病，以红细胞过度积累、严重低氧血症为特征，常并发心脑血管意外等多种致死率较高的严重疾病,其发病机制迄今仍未能阐明[1]。促红细胞生成素受体(EpoR)是红细胞发育过程中最有效且最主要的调节激素受体[2]。研究表明，缺氧是刺激机体产生EpoR的重要因子，可上调EpoR在组织中的表达[3]。EpoR高表达于红系集落形成单位(CFU-E)至原红细胞各阶段的红系细胞膜表面，通过与配体Epo结合活化JAK/STAT等多条信号转导途径，促进血红蛋白合成，使CFU-E向成熟红细胞增殖分化[4]。转铁蛋白受体(CD71)是表达于红系祖细胞至网织红细胞各分化阶段的红系特异性标志物之一[5]。2015年1～12月，本研究观察了HAPC大鼠骨髓CD71+细胞EpoR的表达与分布，旨在为阐释HAPC的发病机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠48只，健康SPF级，2月龄,体质量(200±20)g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(陕)2012-003，合格证号61001700000509。试剂及仪器：大鼠骨髓单个核细胞分离试剂盒购自中国TBD公司，兔抗大鼠EpoR多克隆抗体、小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体、山羊抗兔IgG-FITC购自美国Santa Cruz公司，HRP标记的二抗IgG购自北京中杉金桥生物有限公司。TRIzol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit购自加拿大Fermentas公司，SYBR Green PCR Master Mix购自美国Bio-Rad公司。

1.2 HAPC模型建立 将48只雄性SD大鼠随机分为HAPC组和对照组，每组24只。参照文献[6]方法，HAPC组自西安交通大学医学部运至海拔4 300 m的青海省玉树州珍琴乡饲养，对照组在海拔2 250 m的西宁饲养。饲养40 天两组均经尾静脉采血，采用全自动生化分析仪检测RBC、Hb、红细胞压积(HCT)；经颈动脉插管取血行动脉血气分析，检测动脉血氧饱和度(SaO2)；取股骨骨髓涂片后进行细胞分类计数，记录每一视野下200个细胞中粒系细胞、红系细胞及红系细胞分类的数量，计算粒红比，结果见表1～3。参照2004年第六届国际高原医学和低氧生理学术大会制订的慢性高原病青海诊断标准[7]证实HAPC组模型制备成功。

表1 两组血液学参数比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05。

表2 两组粒系细胞、红系细胞数量及粒红比比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

注：与对照组比较，*P<0.05。

1.3 相关指标观察

1.3.1 骨髓单个核细胞(MNC)增殖活性 采用CCK-8法。两组均采用密度梯度离心法[8]制备MNC悬液。接种于含20% FBS、20 ng/μL IL-3、3 μmol/mL Epo的IMDM培养体系中，接种细胞密度为1×105/mL。HAPC组置于37 ℃、3% O2、92% N2、5% CO2的饱和湿度低氧培养箱中，对照组置于37 ℃、5% CO2饱和湿度常氧培养箱中，培养72 h。加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，以OD450表示MNC增殖活性，每组设置3个复孔。

1.3.2 红系细胞增殖活性 采用单层半固体培养法。将两组MNC密度调整为5×104/mL，接种于含20% FBS、20 ng/μL IL-3、3 μmol/mL Epo的甲基纤维素培养基。HAPC组置于37 ℃、3% O2、92% N2、5% CO2的饱和湿度低氧培养箱中，对照组置于37 ℃、5% CO2饱和湿度常氧培养箱中，培养3天。倒置显微镜下观察，以大于8个细胞的集落计为1个CFU-E，以CFU-E数量表示红系细胞增殖活性。

1.4 骨髓CD71+细胞EpoR分布

1.4.1 细胞膜EpoR表达 ①采用免疫荧光法检测：参照上法分离MNC，采用PE-CD71、Anti-PE MicroBeads相结合的免疫磁珠间接分选法分选两组骨髓CD71+细胞，调整细胞密度为1×106/mL。滴片后采用4%多聚甲醛固定10 min。加入一抗EpoR(1∶50)，室温1 h后4 ℃过夜；加入二抗IgG-FITC (1∶200)，37 ℃孵育1 h，加入DAPI 37 ℃孵育15 min。封片，荧光显微镜下观察细胞膜表面EpoR荧光情况。②采用ELISA法[9]检测：参照上法分选两组CD71+细胞，4%多聚甲醛固定15 min，正常羊血清封闭30 min。加入一抗EpoR(1∶250)，4 ℃过夜；加入HRP标记的IgG(1∶80 000)37 ℃孵育1 h，TMB显色剂室温显色10 min，终止反应，测定OD450，ddH2O洗板。0.08%结晶紫室温孵育20 min，33%冰醋酸室温孵育30 min，测定OD550。细胞膜EpoR表达以OD450/OD550表示，每组设置5个复孔，同时设置空白对照孔和阴性对照孔，实验重复3次。

1.4.2 细胞质EpoR表达 采用ELISA法。参照上法分选两组CD71+细胞，采用反复冻融法提取细胞质蛋白，依照Rat Erythropoietin receptor(EpoR)ELISA Kit说明书检测细胞质EpoR表达。每组设3个复孔，同时设置空白对照孔，实验重复3次。

1.5 骨髓CD71+细胞EpoR mRNA及其蛋白相对表达量检测

1.5.1 EpoR mRNA相对表达量 采用Real-time PCR法。参照试剂盒说明书提取两组CD71+细胞总RNA，逆转录合成cDNA。EpoR上游引物：5′-CCGGGATGGGCTTCAACTAC-3′，下游引物：5′-TCCAGTGGCACAAAACTCGAC-3′，引物长度：101 bp；以β-actin为内参，上游引物：5′-GATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物：5′-TCATCGTACTCCTGCTTGCT-3′，引物长度：144 bp。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。反应条件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，40个循环。每个样本重复3次。以2-ΔΔCt法计算骨髓CD71+细胞EpoR mRNA相对表达量。

1.5.2 EpoR蛋白相对表达量 采用Western blotting法。参照试剂盒说明书采用RIPA裂解液提取两组CD71+细胞总蛋白，BCA法定量后进行12%的SDS-PAGE电泳，蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗EpoR(1∶350)4 ℃过夜，加入二抗(1∶80 000)室温孵育1 h，ECL发光压片显色。以β-actin为内参，以目的条带吸光度与β-actin条带吸光度的比值计算目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 两组MNC及骨髓红系细胞增殖活性比较 HAPC组和对照组OD450分别为1.54±0.035、1.17±0.05，CFU-E数量分别为(61.25±6.84)、(12.90±4.39)个；两组比较P均<0.01。

2.2 两组骨髓CD71+细胞EpoR分布比较 免疫荧光显微镜下可见两组细胞膜表面均有环形或半环形的绿色荧光，但HAPC组细胞膜表面EpoR荧光强度和表达EpoR荧光的细胞数量均高于对照组。HAPC组细胞膜EpoR表达为2.41±0.03，对照组为1.55±0.06；两组比较P<0.05。HAPC组细胞质EpoR表达为96.39±0.42，对照组为94.49±0.65，两组比较P>0.05。

2.3 两组骨髓CD71+细胞EpoR相对表达量比较 HAPC组和对照组骨髓CD71+细胞EpoR mRNA相对表达量分别为8.27±0.15、6.93±0.21，EpoR蛋白相对表达量分别为1.73±0.12、1.09±0.11；两组比较P均<0.05。

3 讨论

EpoR是无酪氨酸激酶活性的细胞因子受体超家族的一员，在正常红系细胞表面表达极低，且很少能在细胞膜上循环利用[10,11]。EpoR主要表达于CFU-E形成阶段，并随着RBC的成熟而表达降低，网织红细胞和成熟红细胞表面缺乏EpoR。研究证实，EpoR基因表达失调可引起红系细胞生成障碍[12]。EpoR与其配体Epo结合形成同源二聚体后，激活与受体相连的Janus激酶(JAK2)，启动JAK2/STAT5、JAK2/PI3K、JAK2/ERKs、NF-κB、JAK2/Ras/MAPK等多个信号转导途径，活化多种红系细胞特异性因子，促进CFU-E增殖分化并抑制其凋亡，及时扩充正常成熟RBC数量以确保组织氧供[13]。有研究对怀孕18天的大鼠进行短暂低氧暴露，结果发现大鼠少突胶质细胞和神经元EpoR表达增加[14]。Spandou等[15]发现，持续缺血缺氧24 h大鼠脑组织中EpoR mRNA表达量显著增高。Theus等[16]发现，缺氧的胚胎鼠脑神经原中EpoR表达量可升高10倍。Beleslin-Cokic等[17]发现，低氧可以刺激内皮细胞EpoR表达。以上研究均提示EpoR的表达是受低氧诱导的，因此推测高原缺氧环境可能对EpoR的表达有影响。

既往对HAPC的发病机制从多层面进行了研究，认为低氧刺激Epo分泌增多是高原RBC过度增殖的内在分子机制[18]。但患者在高原环境停留一段时间后Epo可不再升高或出现下降，而RBC数量却持续升高，甚至部分HAPC患者Epo水平接近于同海拔的健康人，说明Epo并不是高原低氧条件下RBC数量持续增高的惟一原因。吴洲等[19]研究发现，高原缺氧大鼠骨髓细胞EpoR的亲和力表现为一过性升高，其数量在整个缺氧过程中呈现显著升高的趋势。因此，EpoR在高原低氧刺激RBC过度增殖过程中的作用不容忽视。

本研究结果显示，HAPC组OD450明显高于对照组，同时CFU-E数量显著升高，提示高原低氧诱导下HAPC组MNC及骨髓红系细胞的增殖能力增强。EpoR分布结果显示，HAPC组骨髓CD71+细胞膜EpoR表达高于对照组，但两组细胞质中的表达无明显差异，提示高原低氧条件下骨髓CD71+细胞EpoR表达主要集中于细胞膜。分析原因，可能是EpoR蛋白表达总量增高，进而促使细胞质EpoR向细胞膜表面迁移，这样可加强红系细胞对Epo的反应性，有利于启动细胞内信号转导通路，达到扩充成熟RBC的目的。本研究发现，HAPC组骨髓CD71+细胞EpoR mRNA及蛋白表达均明显高于对照组。提示高原低氧诱发EpoR表达，使EpoR在细胞膜表面的表达升高，产生对Epo敏感性增强的异常效应，从而促进MNC的过度增殖分化，参与HAPC的发生、发展。但是高原低氧环境上调EpoR表达的机制尚不明了，需进一步探讨。

综上所述，HAPC大鼠骨髓CD71+细胞EpoR表达升高，其分布多集中于细胞膜表面，这种表达及分布变化可能造成机体对Epo的异常敏感，进而引发相关信号通路的瀑布式激活过程，促进MNC及骨髓红系细胞的增殖，从而参与HAPC的发生、发展。

[1] Simonson TS, McClain DA, Jorde LB, et al. Genetic determinants of tibetan high-altitude adaptation[J]. Hum Genet, 2012,131(4):527-533.

[2] Suzuki N, Mukai HY, Yamamoto M. In vivo regulation of erythropoiesis by chemically inducible dimerization of the erythropoietin receptor intracellular domain[J]. PLoS One, 2015,10(3):76-82.

[3] Haase VH. Hypoxic regulation of erythropoiesis and iron metabolism[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2010,299(1):1-13.

[4] Watowich SS. The erythropoietin receptor: molecular structure and hematopoietic signaling pathways[J]. J Investig Med, 2011,59(7):1067-1072.

[5] Marsee DK, Pinkus GS, Yu H. CD71(transferrin Receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens[J]. Am J Clin Pathol, 2010,134(3):429-435.

[6] 靳国恩,韵海霞,马兰,等.高原红细胞增多症动物模型的建立及其生理功能反应[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,24(13):4713-4716.

[7] 中华医学会高原医学分会.关于统一使用慢性高原(山)病“青海标准”的决定[J].高原医学杂志,2007,17(1):1-2.

[8] 张岩岩,李静,贾道勇,等.当归多糖对衰老模型大鼠骨髓造血功能的影响及其机制[J].解剖学报,2014,45(6):785-792.

[9] Kvale D, Brandtzaeg P. Immune modulation of adhesionmolecules ICAM-1(CD54)in human hepatocytic cell lines[J]. J Hepatol, 1993,17(3):347-352.

[10] Rogers H, Wang L, Yu X, et al. T-cell acute leukemia 1 (TAL1) regulation of erythropoietin receptor and association with excessive erythrocytosis[J]. J Biol Chem, 2012,287(44):36720-36731.

[11] Elliott S, Sinclair A, Collins H, et al. Progress in detecting cell-surface protein receptors: the erythropoietin receptor example[J]. Ann Hematol, 2014,93(2):181-192.

[12] Rankin EB, Wu C, Khatri R, et al. The HIF signaling pathway in osteoblasts directly modulates erythropoiesis through the production of EPO[J]. Cell, 2012,149(1):63-74.

[13] Robinson NJ, Winge DR. Copper metallochaperones[J]. Annual Rev Biochem, 2010,79(1):537-562.

[14] Mazur M, Miller RH, Robinson S. Postnatal erythropoietin treatment mitigates neural cell loss after systemic prenatal hypoxic-ischemic injury[J]. J Neurosurg Pediatr, 2010,6(3):206-221.

[15] Spandou E, Papoutsopoulou S, Soubasi V, et al. Hypoxia-ischemia affects erythropoietin and erythropoietin receptor expression pattern in the neonatal rat brain[J]. Brain Res, 2004,1021(2):167-172.

[16] Theus MH, Wei L, Cui L, et al. In vitro hypoxic preconditioning of embryonic stem cells as a strategy of promoting cell survival and functional benefits after transplantation into the ischemic rat brain[J]. Exp Neurol, 2008,210(2):656-670.

[17] Beleslin-Cokic BB, Cokic VP, Yu X, et al. Erythropoietin and hypoxia stimulate erythropoietin receptor and nitric oxide production by endothelial cells[J]. Blood, 2004,104(7):2073-2080.

[18] Debevec T, Keramidas ME, Norman B, et al. Acute short-term hyperoxia followed by mild hypoxia does not increase EPO production: resolving the ｀normobaric oxygen paradox＇[J]. Eur J Appl Physiol, 2012,112(3):1059-1065.

[19] 吴洲,宋玲,高钰琪,等.模拟高原缺氧大鼠骨髓细胞EpoR亲和力及数量的测定[J].西南国防医药,2006,16(4):360-362.

Changes of expression and distribution of EpoR in myeloid CD71+cells of rats with high altitude polycythemia

LIUFang1,FENGTingting,JILinhua,HANYuanfang,DINGJin

(1MedicalCollegeofQinghaiUniversity,Qinghai810000,China)

Objective To observe the changes of expression and distribution of EpoR in myeloid CD71+cells of rats with high altitude polycythemia (HAPC) and to investigate the significance. Methods Forty-eight male SD rats were randomly divided into the HAPC group and control group, with 24 rats in each group. Rats in the HAPC group and control group were fed for 40 days under natural environment at altitude of 4300 meters and 2250 meters respectively and verified by hematology parameters [RBC, Hb, hematocrit (HCT), arterial oxygen saturation (SaO2)]detection and bone marrow cells counts. RBC, Hb, HCT, erythrocytic proportion, polychromatic erythroblast proportion and orthochromatic proportion of the HAPC group were higher than those of the control group, SaO2was lower than the control group (allP<0.05), which indicated that the establishment of rat model with HAPC was successful. We used the density gradient centrifugation to prepare the bone marrow mononuclear cell (MNC) suspension in both groups. The proliferation of MNC in the two groups was detected by CCK8 (manifested by OD450) and the colony formation of Colony Forming Unit-erythroid (CFU-E) was detected by ingle layer semisolid culture method. Myeloid CD71+cells were separated from MNC in the two groups by magnetic activated cell sorting method. Then EpoR fluorescence on the membrane surface of the two groups was observed by immunofluorescence assay. EpoR expression of cell membrane and cytoplasm was measured by ELISA. The relative expression of EpoR mRNA and protein was detected by real-time PCR and Western blotting. Results The OD450of HAPC group and control group were 1.54±0.035 and 1.17±0.05, respectively; the CFU-E colony formation of the two groups were 61.25±6.84 and 12.90±4.39, respectively (allP<0.01). The immunofluorescence results showed that a ring or semi-annular green fluorescence appeared on the surface of cell membrane in the two groups. However, the fluorescence intensity of EpoR on cell surface and the number of cells expressing EpoR fluorescence of the HAPC group were higher than thsoe of the control group. EpoR expression in cell membrane of the HAPC group and control group was 2.41±0.03 and 1.55±0.06, respectively (P<0.05). EpoR expression of cytoplasm in the HAPC group and control group was 96.39±0.42 and 94.49±0.65, respectively (P>0.05). The relative expression of EpoR mRNA and protein in myeloid CD71+cells of HAPC group was higher than that in the control group (allP<0.05). Conclusion The expression of EpoR in myeloid CD71+cells of HAPC rats is increased and its distribution is concentrated on the surface of the cell membrane, which might be related to the occurrence and development of HAPC by promoting the proliferation of MNC and erythroid cells.

high altitude polycythemia; CD71+cells; erythropoietin receptor; rats

国家自然科学基金资助项目(81441116)；青海省科技厅(应用)基础研究计划项目(2012-Z-729)；青海大学“123高层次人才培养工程”中青年学术带头人基金项目；青海大学医学院中青年科研基金团队项目(2014-KT-1)。

刘芳(1972-)，女，教授，研究方向为慢性高原病的发病机制。E-mail： qhxnlf2006@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.005

R555.1

A

1002-266X(2016)32-0015-04

2016-01-26)