miR-33a-5p对骨肉瘤细胞Saos-2增殖的影响及其机制

袁忠，胡俊，雷家维，付璐珩，俞曾强，汪海燕

(江西中医药大学附属洪都中医院，南昌330006)

miR-33a-5p对骨肉瘤细胞Saos-2增殖的影响及其机制

袁忠，胡俊，雷家维，付璐珩，俞曾强，汪海燕

(江西中医药大学附属洪都中医院，南昌330006)

目的 观察miR-33a-5p对骨肉瘤细胞Saos-2增殖的影响，并探讨其相关机制。方法 采用Real time-PCR法检测骨肉瘤细胞Saos-2及正常人成骨细胞hFOB1.19中miR-33a-5p mRNA相对表达量。将对数生长期的骨肉瘤细胞Saos-2分为两组，分别转染miR-33a-5p mimics(mimics组)及Scramble(对照组)。采用MTT法检测两组培养24、48、72、96及120 h细胞增殖能力，细胞克隆形成实验检测细胞克隆形成能力(以克隆形成率表示)，流式细胞术比较细胞周期，Westen blotting法检测细胞周期蛋白激酶2(CDK2)、CDK4、细胞周期蛋白D(CyclinD)及CyclinE蛋白相对表达量。结果 骨肉瘤细胞Saos-2及正常人成骨细胞hFOB1.19中miR-33a-5p mRNA相对表达量分别为2.65±0.43和24.32±3.21，两者比较P<0.01。随着培养时间延长，两组细胞增殖能力均呈升高趋势；与对照组同时间点比较，mimics组细胞增殖能力均降低(P均<0.01)。mimics组和对照组克隆形成率分别为25.34%±3.46%、53.27%±5.82%,两组比较P<0.01。mimics组和对照组分别有46.37%±4.28%、30.64%±3.52%的细胞处于G1期，分别有13.25%±1.25%、22.62%±2.01%的细胞处于G2期，两组比较P均<0.01。mimics组CDK2、CDK4、CyclinD、CyclinE蛋白相对表达量均低于对照组(P均<0.01)。结论 骨肉瘤细胞Saos-2中miR-33a-5p表达降低，上调其表达可抑制细胞增殖；下调 CDK2、CDK4、Cyclin D及Cyclin E等细胞周期相关蛋白的表达可能为miR-33a-5p的作用机制。

骨肉瘤；Saos-2细胞；miR-33a-5p；细胞增殖

骨肉瘤好发生于股骨远端、胫骨及肱骨，治疗方法包括手术、化疗、放疗及综合治疗[1]。骨肉瘤患者的5年生存率较低，仅为63%[2]。微小RNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA，其长度约为22个核苷酸，调节超过30%的人体基因，参与细胞分化、增殖、凋亡及细胞周期调控等各种生物学过程[3～6]。miR-33a-5p属于新发现的miR-33a家族成员，目前对其具体功能所知甚少。2015年1月～2016年1月，我们观察了骨肉瘤细胞Saos-2中miR-33a-5p表达变化，现分析结果，探讨其对细胞增殖的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 骨肉瘤细胞Saos-2及正常人成骨细胞hFOB1.19均购自南昌大学实验医学中心。实验所需一抗均购自美国Santa Cruz公司，HRP标记的二抗均购自英国Abcam公司，MTT试剂盒和亚甲基蓝均购自美国Sigma公司，miR-33a-5p mimics及Scramble均由上海吉马制药技术有限公司合成。

1.2 细胞miR-33a-5p mRNA相对表达量检测 采用Real time-PCR法。取对数生长期的骨肉瘤细胞Saos-2及正常人成骨细胞hFOB1.19，采用TRIzol试剂提取总RNA。以总RNA为模板，使用M-MLV反转录酶在25 μL体系中对cDNA进行反转录。采用SYBR Green Ⅰ mix试剂盒于ABI VIIA7荧光定量PCR仪上进行检测。miR-33a-5p上游引物：5′- GGTGCATTGTAGTTGCATTGC-3′，下游引物5′- GTGCAGGGTCCGAGGTATTC -3′。以GAPDH为内参，上游引物5′-GACTTCAACAGCAACTCCCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，40个循环。以2-ΔΔCt法计算miR-33a-5p mRNA相对表达量。

1.3 细胞分组处理 将对数生长期的骨肉瘤细胞Saos-2分为mimics组及对照组，参照李振华等[7]的方法利用Lipofectamine 2000转染试剂分别转染miR-33a-5p mimics(可以增强细胞miR-33a-5p表达)及Scramble(把RNA序列打乱，对目的基因表达无影响)。将两组加入DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中进行培养，取对数生长期细胞用于以下实验。

1.4 miR-33a-5p表达对骨肉瘤细胞Saos-2增殖的影响

1.4.1 细胞增殖能力 采用MTT法。取对数生长期的两组细胞，以1×104个/孔接种于96孔板中，分别于培养24、48、72、96及120 h每孔加入40 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。孵育4 h后每孔加入200 μL 二甲基亚砜(DMSO)，置于摇床上充分震荡。采用酶标仪检测两组各时间点570 nm处的吸光度(OD)值，每组设置6个复孔，取平均值。

1.4.2 细胞克隆形成能力 采用细胞克隆形成实验。取对数生长期的两组细胞，以1×104个/孔接种于96孔板中，培养24 h时接种于12孔板中，每孔接种600个细胞。培养8 d去除培养液，用PBS冲洗3次，甲醇固定20 min；1%亚甲基蓝染色40 min,去离子水清洗2次，晾干。40倍显微镜下计算>50个细胞的克隆数量，计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。每组设置3个复孔，实验重复3次，取平均值。

1.4.3 细胞周期 采用流式细胞术。取对数生长期的两组细胞，以1×104个/孔接种于96孔板中，培养24 h时PBS洗涤2次，70%乙醇固定，4 ℃保存过夜。PBS冲洗1次，将细胞密度调整为1×106个/mL。加入碘化丙啶染色液，至终浓度为0.05 mg/mL，4 ℃染色30 min。上流式细胞仪对两组细胞周期进行分析。每组设置3个复孔，实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞周期相关蛋白相对表达量检测 采用Westen blotting法。取对数生长期的两组细胞，采用RIPA裂解液裂解，PMSF处理后冰上孵育30 min。4 ℃条件下12 000 r/min离心30 min，取上清蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜上。分别加入一抗anti-细胞周期蛋白激酶2(CDK2)、anti-CDK4、anti-细胞周期蛋白D(CyclinD)以及anti-Cyclin E(1∶2 000),加入anti-GAPDH、HRP标记的二抗(1∶2 000)，通过ECL法进行显影。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标条带的平均光密度值。以目的蛋白与GAPDH蛋白平均光密度值的比值计算细胞CDK2、CDK4以及CyclinD、CyclinE蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 骨肉瘤细胞Saos-2及正常人成骨细胞miR-33a-5p相对表达量比较 miR-33a-5p在骨肉瘤细胞Saos-2及正常人成骨细胞hFOB1.19中的相对表达量分别为2.65±0.43和24.32±3.21，两者比较P<0.01。

2.2 两组细胞增殖相关指标比较

2.2.1 细胞增殖能力 随着培养时间的延长，两组细胞增殖能力均呈升高趋势；与对照组同时间点比较，mimics组细胞增殖能力均降低(P均<0.01)。见表1。

表1 两组细胞增殖能力比较±s)

注：与对照组同时间点比较，*P<0.01。

2.2.2 细胞克隆形成能力 mimics组和对照组克隆形成率为25.34%±3.46%、53.27%±5.82%，两组比较P<0.01。

2.2.3 细胞周期 mimics组和对照组分别有46.37%±4.28%、30.64%±3.52%的细胞处于G1期，分别有13.25%±1.25%、22.62%±2.01%的细胞处于G2期，两组比较P均<0.01。

2.3 两组细胞周期相关蛋白相对表达量比较 mimics组CDK2、CDK4、CyclinD、CyclinE蛋白相对表达量均低于对照组(P均<0.01)。见表2。

表2 两组细胞周期相关蛋白相对表达量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.01。

3 讨论

骨肉瘤主要累及骨髓腔及骨皮质，波及骨外膜时可形成特征性的三角形隆起，患者生存率较低[8]。近年来，一系列的医学研究指出miRNA表达失调与多种肿瘤的发病相关，包括结肠癌、乳腺癌、骨肉瘤等[9～11]。Kobayashi等[3]通过7个骨肉瘤样本的miRNA表达谱证实多个miRNA表达失调，包括miR-34、miR-140、miR-92a、miR-99b、miR-193a-5p等。miR-33a-5p属于miR-33a家族成员，是近期发现的一种miRNA，目前对其具体生理功能所知甚少。文献报道,miR-33a-5p参与调节T细胞功能[12]，并在肝癌细胞中参与调节β-catenin信号通路[13]。

miRNA mimics是一种化学方法人工合成的成熟miRNA片段,能模拟生物体内源性miRNAs[14]。通过转染miRNA mimics能人为增加目标miRNA的表达，从而凸显出目标miRNA的功能。miRNA Scramble是采用化学方法人工合成的随机miRNA片段，无靶向性基因调控效应，多用作阴性对照。本研究结果显示，miR-33a-5p在骨肉瘤细胞Saos-2中的相对表达量明显低于正常人成骨细胞hFOB1.19，说明骨肉瘤的发病与miR-33a-5p表达降低有关。由于miR-33a-5p在骨肉瘤细胞内低表达，若采用常规基因沉默方法，将骨肉瘤细胞中miR-33a-5p表达进一步降低，则其表达变化幅度较小，难以体现其调控功能。因此本研究通过转染miR-33a-5p mimics，人为增加miR-33a-5p表达，能显著体现其对骨肉瘤细胞增殖的调控作用。本研究结果显示，随着培养时间的延长，两组细胞增殖能力均呈升高趋势；与对照组同时间点比较，mimics组细胞增殖能力均降低；mimics组克隆形成率也明显低于对照组。证实miR-33a-5p对骨肉瘤细胞具有增殖抑制作用。细胞周期分为分裂间期和分裂期，分裂间期又分为G1期、S期及G2期。若细胞停留在G1期，则该细胞被称为休止细胞或G0期细胞[15]。本研究结果表明，mimics组处于G1期的细胞比例明显高于对照组，处于G2期的细胞比例明显低于对照组。证实miR-33a-5p可诱导骨肉瘤细胞Saos-2停滞于G1期，从而抑制细胞增殖。

细胞周期蛋白(Cyclins)是一类对细胞周期进行调节的蛋白，其中CyclinD和CyclinE分别在G1期和S期进行表达，并对细胞分裂增殖起促进作用[16]。细胞周期蛋白激酶(CDKs)是一类调节细胞周期，具有促进细胞增殖作用的激酶[17]。CDK2与CDK4的功能在于促进细胞从G1期进入S期，进而促进细胞增殖。本研究结果显示，mimics组CDK2、CDK4、CyclinD、CyclinE蛋白相对表达量均低于对照组，表明上述蛋白表达降低可能是miR-33a-5p抑制细胞增殖的机制之一。

综上所述，骨肉瘤细胞Saos-2中miR-33a-5p表达降低，上调其表达后可抑制细胞增殖；下调CDK2、CDK4、CyclinD及CyclinE等细胞周期相关蛋白的表达可能为miR-33a-5p的作用机制。miR-33a-5p在体外实验中表现出抑癌基因的功能，其作为一种新发现的miRNA，对抑制骨肉瘤细胞增殖具有重要作用，可能成为未来治疗骨肉瘤新的作用靶点。

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Effect and mechanism of miR-33a-5p on the proliferation of osterosarcoma cells Saos-2

YUANZhong,HUJun,LEIJiawei,FULuheng,YUZengqiang,WANGHaiyan

(HongduHospitalAffiliatedtoJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of miR-33a-5p on the proliferation of osteosarcoma cancer cells Saos-2. Methods RT-PCR was conducted to investigate the expression level of miR-33a-5p in Saos-2 cells and hFOB1.19 cells. Saos-2 cell line was divided into two groups, the mimics group was transfected with miR-33a-5p mimics and the control group was transfected with Scramble. The proliferation ability was analyzed by MTT cell viability assay at 24, 48, 72, 96 and 120 h of cultivation, the cloning ability was detected by clone-formation assay, the cell cycle was detected by flow cytometry, and the expression levels of CDK2, CDK4, CyclinD and CyclinE were measured by Western blotting. Results The expression levels of miR-33a-5p were 2.65±0.43 in the miR-33a-5p mimics group and 24.32±3.21 in the control group, respectively,P<0.01. The OD value of the two groups was increased as culturing. The OD value of mimics group was lower than that of the control group (allP<0.01). The clone-formation rate was 25.34%±3.46% in mimics group, which was significantly lower than that of the control group (53.27%±5.82%),P<0.01. There was 46.37%±4.28%% of the total mimics group of Saos-2 cells in the G1 phase, much higher than 30.64% ±3.52% in the control group; the percentage of G2phase in the mimics group was 13.25%±1.25%, which was much lower than 22.62%±2.01% in the control group (allP<0.01). The expression level of CDK2, CDK4, Cyclin D and Cyclin E in the mimics group was significantly lower than that of the control group (allP<0.01). Conclusion The miR-33a-5p expression was reduced, and up-regulation of miR-33a-5p may inhibit the proliferation of osterosarcoma cells Saos-2, whose mechanism may be down-regulating the cell cycles of CDK2, CDK4, Cyclin D and Cyclin E.

osteosarcoma; Saos-2 cells; miR-33a-5p; cell proliferation

袁忠(1969-)，男，副主任医师，研究方向为骨肿瘤及骨质疏松。E-mail： yuanzhong122@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.002

R738.1

A

1002-266X(2016)32-0005-04

2016-02-27)