荧光原位杂交技术在套细胞淋巴瘤石蜡切片的应用研究

吴蔚，倪军，王红，孙幸，方悦之，顾健

(江苏省苏北人民医院，扬州市血液学研究所实验室，江苏扬州225001)



荧光原位杂交技术在套细胞淋巴瘤石蜡切片的应用研究

吴蔚，倪军，王红，孙幸，方悦之，顾健

(江苏省苏北人民医院，扬州市血液学研究所实验室，江苏扬州225001)

摘要:目的建立淋巴瘤石蜡切片应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测的操作流程，探讨其在套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）诊断中的应用价值。方法优化石蜡切片FISH检测步骤和实验条件，在16例病理拟诊断MCL的石蜡切片上应用FISH检测IGH/CCND1融合基因。结果确立了本实验室石蜡切片FISH检测的实验方法和条件；拟诊断MCL的病例中IGH/CCND1融合基因阳性检出率为75%（12/16）。结论淋巴瘤石蜡切片FISH检测可满足临床应用要求；应用FISH技术检测IGH/CCND1融合基因有助于MCL的诊断。

关键词：荧光原位杂交；石蜡包埋；套细胞淋巴瘤；IGH/CCND1

淋巴瘤是一组异质性疾病，分类复杂，依据形态学和免疫组化鉴别有时仍难以确诊和准确分型。2008年WHO修订和出版的第4版《造血和淋巴组织肿瘤》WHO分类，淋巴瘤诊断标准包括形态学特征、免疫特征、遗传学改变，提出特异性的遗传学改变是淋巴瘤的重要诊断指标。

大部分恶性淋巴瘤只有在晚期侵犯骨髓时，骨髓的细胞遗传学分析才能发现异常染色体；在临床研究中，很难取得新鲜的病理组织制成单个核细胞悬液行遗传学分析，所以淋巴瘤早期遗传学信息比较缺乏。

为满足淋巴瘤临床诊断和分型提出的更高要求，提高本实验室淋巴瘤的遗传学研究，我们在病理拟诊断套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）的石蜡切片上利用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）检测t(11；14) (q13；q32)形成的IGH/CCND1融合基因，探索本实验室FISH检测石蜡切片的最佳实验条件，建立本实验室的操作步骤；初步评估FISH检测IGH/CCND1融合基因在MCL诊断的应用价值。

1　对象与方法

1.1病例资料选择了江苏省苏北人民医院2010 年1月至2014年12月病理拟诊断MCL的石蜡切片16例，切片标本由病理科提供，诊断依据张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[1]。其中男12例，女4例，年龄59～75岁，平均为67岁。对照组为5例反应性增生的淋巴结石蜡切片。

1.2主要试剂和仪器位点特异性探针GLP IGH/ GLP CCND1购自北京金菩嘉医疗科技有限公司；胃蛋白酶购自SIGMA公司；荧光显微镜：Olympus BX51荧光显微镜（日本Olympus公司）；FISH图像分析软件：Imstar FISH 3.0进行图像采集和保存。

1.3方法

1.3.1根据本实验室骨髓细胞FISH检测[2]，查阅文献[3－5]，建立初步的石蜡切片的FISH检测步骤，发现杂交信号分析存在的问题：细胞核轮廓不清，出现重叠，信号杂乱无法分析等。

1.3.2优化实验条件⑴石蜡切片厚度设为4μm。⑵脱蜡：初始的实验方法建议用高压锅煮沸EDTA溶液，将玻片浸入进行抗原修复。此步骤在临床操作过程中烦琐，效果不好控制。我们改为：将玻片泡在蒸馏水（枸橼酸钠溶液）中用微波炉水煮，中高火5min，高火5min，待自然冷却后取出。在光学显微镜下观察细胞轮廓是否清楚，背景是否干净调整时间。这样效果可控，操作可行。⑶初始使用胃蛋白酶的浓度为及消化时间：50mg/0.5ml胃蛋白酶储存液，10min。我们改为：消化10min后，晾干玻片，加10μl DAPI盖上盖玻片，在荧光显微镜下DAPI通道下观察细胞核，根据是否出现完整、清晰的细胞决定是否需要进一步消化。如消化不完全，用2×SSC 1min洗去DAPI，继续在胃蛋白酶中消化2～3min。⑷血液标本常规变性的温度78℃，但在石蜡切片上信号比较散，我们改为83℃。

3 FISH结果判断IGH/CCND1融合基因结果判断：IGH基因位于14号染色体长臂3区2带断裂点，由绿色荧光素标记；CCND1基因位于11号染色体长臂1区3带断裂点，由红色荧光素标记。正常细胞为两红两绿，异常细胞为二黄一红一绿。

5例反应性增生的淋巴结石蜡切片应用FISH检测IGH/CCND1融合基因，观察200个细胞，有黄色融合信号的细胞为假阳性细胞。以阳性细胞数>平均数+ 3个标准差（x+3s）作为标准。5%以上的细胞出现异常的IGH/CCND1融合信号被判断为阳性结果。

2　结果

2.1优化后FISH检测步骤⑴烤片：切好的片子于56℃烤片2h，待出现小蜡珠时，于二甲苯中进行脱蜡。⑵脱蜡：室温，二甲苯2min 2次，100%乙醇2min。⑶梯度酒精复水：室温，100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各3min。⑷抗原修复：将玻片泡在枸橼酸钠溶液中，用微波炉水煮，中高火5min，高火5min。⑸消化：将40ml 0.01M的HCl溶液37℃进行预热。向HCl溶液加入胃酶0.05g，混合均匀。将切片浸泡消化10min，荧光显微镜下观察消化结果。必要时延长消化时间。⑹消化结束后，室温下将玻片置于2×SSC溶液静置10min。⑺梯度酒精脱水：室温，70%，85%，100%乙醇中各2min脱水，自然干燥玻片。⑻加探针，封片。将玻片放至湿盒，置83℃水浴锅变性6min，移至42℃培养箱杂交过夜；⑼洗片。(10)荧光显微镜下选择细胞分散好区域，分析杂交信号。

2.2图像扫描与图像分析用Olympus BX51荧光显微镜（日本Olympus公司）在UV/Rhodamine/ FITC三色滤光片的激发下观察间期细胞的荧光杂交信号，并用染色体自动分析系统Imstar FISH 3.0进行图像采集和保存。

分析的细胞结构清晰完整，背景荧光信号低，杂交信号强，能够很好的判断结果。病理拟诊断MCL的16例病例中，FISH检测出IGH/CCND1融合基因阳性为12例，如图1、图2。

图1　石蜡切片FISH图像（IGH/CCND1阳性）

图2　石蜡切片FISH图像（IGH/CCND1阴性）

3　讨论

FISH技术起源于20世纪80年代后期，是目前细胞遗传学重要的研究方法之一。基本原理是利用碱基互补配对，将荧光素标记的探针直接杂交到染色体标本上，通过检测荧光信号，对染色体或基因异常进行定性、定位及相对定量的分析。

石蜡切片应用FISH技术检测淋巴瘤遗传学异常始于1999年[6]，利用特异性探针检测淋巴瘤遗传学改变。随着目前淋巴瘤临床诊断、分型的不断细化，FISH技术由于其具有准确度、灵敏度和特异性高等优点，已逐步应用于淋巴瘤临床诊断及科研中。文献报道[7]，利用间期FISH检测早期恶性淋巴瘤的骨髓IgH基因，可以区别良恶性肿瘤。毕蕊[8]等研究表明FISH技术检测淋巴瘤特异的遗传学异常对于复核组织病理诊断、鉴别其类型、亚型及病变的良恶性有重要参考价值。

石蜡切片进行FISH检测存在多方面影响因素[9－12]，如切片的因素、FISH杂交前石蜡切片的前期处理、杂交情况、杂交后洗涤情况等原因，任何环节失误均可能导致检测失败。目前，国内外没有标准化的实验流程，各个实验室均需摸索适合本实验室的条件，建立操作步骤。李海燕[13]等通过优化实验条件，在石蜡包埋组织上成功地进行FISH检测间变性大细胞淋巴瘤病例中ALK基因。王静[14]等研究建议不同实验室在进行FISH技术杂交检测之前，应首先对酶消化时间进行调整。

本研究最初建立的石蜡切片FISH检测步骤，发现杂交信号分析存在的问题：⑴细胞核轮廓模糊，杂交信号杂乱，无法分析；⑵杂交后未见杂交信号；⑶杂交信号弱；⑷荧光背景高，无法分析杂交信号；⑸细胞核重叠导致杂交信号重叠，影响结果判断。通过多次实验条件摸索，我们认为，FISH杂交前的石蜡切片前期处理尤其重要，抗原修复和蛋白酶消化是实验成功的关键步骤。

抗原修复是通过高温或化学处理消除福尔马林固定所致蛋白交联的影响，使探针能通过细胞膜接近靶细胞的DNA序列。此步骤在临床操作过程中烦琐，效果不好控制。我们在高温处理过程中，通过光学显微镜下观察细胞结构，及时调整处理的时间，这样效果可控，操作可行。蛋白酶消化，主要作用为去除胞质，减少背景提高信号强度，并使单个胞核易于辨别，从而使FISH信号更容易分析。合适的消化，能保证探针能顺利进入细胞核内，而消化过度导致目的DNA上的杂交位点被破坏甚至组织切片的脱落。最初我们设定50mg/0.5ml胃蛋白酶37℃，消化时间10min，然后在荧光显微镜下DAPI通道下观察细胞核，根据是否出现完整、清晰的细胞决定是否需要进一步消化。如消化不完全，用2×SSC 1min洗去DAPI，继续在胃蛋白酶中消化2～3min。同时，切片的厚度、及杂交变性的温度对杂交结果分析也至关重要。处理后的细胞结构清晰完整，背景荧光信号低，杂交信号强，能够很好的判断结果。

MCL为非霍奇金淋巴瘤中的一种B细胞淋巴瘤，具有独特的组织病理学、免疫表型和分子遗传学，侵袭性强，患者确诊时多处于高度恶性阶段，对放、化疗均不敏感，预后差。MCL的正确诊断及与其它小B细胞淋巴瘤的鉴别诊断对临床治疗和预后评估均有重要意义。96%～100%的MCL与t (11；14)(q13；q32)密切相关。Chu[15]等提出t(11；14)易位是MCL特异的且有效的诊断标志，对于MCL诊断具有重要意义。Monteil[16]等研究认为FISH检测t(11；14)(q13；q32)易位的特异性和敏感性高于PCR方法。本次研究中，16例病理拟诊断为MCL的患者中，12例FISH检测IGH/CCND1融合基因为阳性，最终临床综合诊断为MCL。

综上研究，我们建议石蜡切片应用FISH检测，不同实验室应建立适合自己的最佳操作流程，实验过程中根据显微镜下观察的细胞结构及时调整实验条件，以保证结果的可分析性以及准确性。淋巴瘤石蜡切片应用FISH检测IGH/CCND1融合基因有助于提高MCL临床诊断率。

参考文献

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[13]李海燕，李甘地，何小金，等.荧光原位杂交检测石蜡包埋间变性大细胞淋巴瘤病例中ALK基因转位及其意义[J].中华医学遗传学杂志，2004，21(5)：470－473.

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·论著·

Applied research of fluorescence in situ hybridization in paraffin section of mantle cell lymphoma

WU Wei，NI Jun，WANG Hong，SUN Xing，FANG Yuezhi，GU Jian. Subei People’s Hospital，Yangzhou Municipal Institute of Hematology，Yangzhou Jiangsu 225001，China.

Abstract：Objective To establish the operation process of fluorescence in situ hybridization(FISH) in paraffin section of lymphoma，and explore the application of FISH in diagnosis of mantle cell lymphoma (MCL). Methods The testing steps and experimental conditions of FISH in paraffin section were optimized，and 16 cases of quasi diagnosis of MCL were detected IGH/CCND1 fusion gene by FISH in paraffin section. Results The experiment methods and conditions of FISH in paraffin section were successfully established in our laboratory，and the positive detection rate of IGH/CCND1 fusion gene was 75%(12/16) in quasi diagnosis cases of MCL. Conclusion It can meet the requirements of clinical application by FISH in paraffin section of lymphoma；and the detection of IGH/CCND1 fusion gene by FISH is useful for the diagnosis of MCL.

Key words:FISH；Paraffin section；MCL；IGH/CCND1

(收稿日期2015－11－24；修回日期2016－02－29)

通信作者：顾健，女，1954年1月出生，教授，主任医师，研究方向血栓与止血、恶性血液病，E- mail:maolujiu918@163.com

作者简介：吴蔚，女，1977年10月出生，硕士学位，副主任技师，研究方向：恶性血液病遗传学。

基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81170104）

中图分类号：R446.8，R551.2

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)02-0134-03

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.002