CD55和CD59检测在阵发性睡眠性血红蛋白尿诊断中的意义

吴琼，王小中

(南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)



CD55和CD59检测在阵发性睡眠性血红蛋白尿诊断中的意义

吴琼，王小中

(南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006)

摘要:目的探讨应用流式细胞术检测CD55和CD59在阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)诊断中的应用价值。方法应用流式细胞术检测贫血患者及健康对照组外周血红细胞和粒细胞的表面抗原CD55、CD59的表达水平，并同时做Ham试验、糖水试验和尿Rous试验。结果健康对照组红细胞和粒细胞CD55-、CD59-的测定结果均小于5%。7例PNH患者红细胞和粒细胞CD55-、CD59-的测定结果均大于5%；20例AA患者中有2例红细胞CD55-、CD59-测定结果大于5%；粒细胞CD55-、CD59-大于5%的有1例；部分IDA患者红细胞CD55-、CD59-大于5%，而粒细胞的结果全部正常；MA和AIHA患者的红细胞和粒细胞CD55-、CD59-的测定结果均正常。7例PNH患者中，Ham试验2例阴性，尿Rous试验1例阴性，而其红细胞和粒细胞CD55-、CD59-的测定结果均大于5%。结论利用流式细胞术同时检测外周血中红细胞和粒细胞CD55和CD59的表达对PNH的诊断具有无可比拟的优势，利于PNH的早期发现，是目前诊断PNH最敏感的方法。

关键词：阵发性睡眠性血红蛋白尿；CD55；CD59；流式细胞术

阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一种获得性造血干细胞基因突变导致的血液病，常在睡眠时加重，可伴随有间歇性血红蛋白尿、全血细胞减少和反复血栓形成等症状。传统方法可通过糖水试验、酸溶血实验（Ham）诊断[1]，但敏感性、特异性较差。近年来研究发现，在正常细胞的膜表面均有多种GPI锚蛋白，主要为补体调节蛋白C3转化酶衰变加速因子（DFA，CD55）和反应性溶血膜抑制物（MIRL，CD59），这两种蛋白能够保护红细胞免于补体介导的溶血。因此，CD55及CD59这两种蛋白质的缺失将直接导致血管内溶血及血红蛋白尿[2]。PNH患者的多数临床表现均可归结于受累细胞表面该类蛋白的缺失[3]。因此，通过检测细胞表面CD55、CD59的缺乏可作为诊断PNH最直接的证据。但有文献报导健康人及常见的其他贫血性疾病也存在不同程度的表达下降[4]，鉴于此，笔者对我院79例各种贫血患者进行CD55、CD59免疫表型观察研究，探讨PNH诊断的敏感指标，现报告如下。

1　对象与方法

1.1对象收集2011年8月－2014年10月门诊、住院病人79例，其中男31例，女48例，年龄14～86岁，平均42岁。各种贫血诊断均参照《血液病诊断及疗效标准》[4]；正常对照选择医院健康体检者30例，其中男18例，女12例，年龄18～49岁，平均37岁，均无贫血史。

1.2方法

1.2.1主要设备和试剂BD公司FACSCalibur流式细胞仪；FITC标记的CD59单克隆抗体，PE标记的CD55单克隆抗体及相应的同型对照IgG2a和溶血素均购自美国BD公司。

1.2.2标本采集和处理采集晨起空腹静脉血2mL，用EDTA－K2抗凝，采血后6h内检测。

1.2.3标本检测

1.2.3.1红细胞标记方法设样品管和对照管，样品管中分别加入CD55－PE和CD59－FITC各20μl，对照管中分别加入IgG2a－PE和IgG2a－FITC 各20μl。每管中加入全血20μl，充分混匀，室温下避光孵育30min。加入0.5mlPBS缓冲液，避光待测。流式细胞仪分析应用Cell Quest软件，在FSCSSC散点图上选定红细胞群，设门圈出欲分析的细胞群体，计算红细胞CD55和CD59的表达。

1.2.3.2粒细胞标记方法设样品管和对照管，样品管中加入CD55－PE、CD59－FITC和CD45－Percp 各20μl，对照管中加入IgG2a－PE、IgG2a－FITC和CD45－Percp各20μl。分别加入全血50μl，充分混匀，室温下避光孵育30min。加入溶血素1ml，充分混匀，室温下避光反应10min后1200r/min转离心5min，弃上清，PBS洗涤2次后加入0.5mLPBS重悬细胞，避光待测。在CD45－SSC散点图上选定粒细胞群，设门圈出欲分析的细胞群体，计算粒细胞上CD55和CD59的表达。

1.2.3.3 Ham试验、糖水试验和尿Rous试验等溶血检测指标，按照国内外统一溶血检验操作规程[5]。

1.2.3.4判断标准以正常人红细胞和粒细胞的CD55、CD59表达设定阴性阈值，CD55－、CD59－百分率小于5%认为正常，CD55－、CD59－的百分率大于5%认定为有PNH克隆[6－8]。

2　结果

2.1红细胞和粒细胞CD55、CD59的表达率贫血患者及健康对照组外周血细胞CD55和CD59测定结果见表1。所有健康人中红细胞和粒细胞的CD55－和CD59－百分率均小于5%；7例PNH患者红细胞和粒细胞CD55－、CD59－的测定结果均大于5%；20例再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）患者中有2例AA患者红细胞CD55－、CD59－测定结果大于5%；粒细胞CD55－、CD59－大于5%的有1例；33例缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）患者中有2例患者红细胞CD55－、CD59－测定结果大于5%，而粒细胞的结果全部正常；巨幼细胞性贫血（megaloblastic anemia，MA）和自身免疫溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia，AIHA）患者红细胞和粒细胞CD55－、CD59－的测定结果均在正常范围。

表1　健康对照组及贫血患者外周血CD55-和CD59-细胞检测结果

2.2糖水试验、Ham试验、尿Rous试验的结果比较糖水试验、Ham试验和尿Rous试验的测定结果见表2。7例PNH病人糖水试验全是阳性；酸溶血试验2例阴性；尿Rous试验1例阴性。20例AA患者中有6例糖水试验阳性；Ham试验和尿Rous试验均是阴性。其余病人糖水试验、Ham试验、尿Rous试验均阴性。

表2　健康对照组和贫血患者其他检测指标比较

3　讨论

PNH是一种获得性造血干细胞克隆缺陷性疾病，病变细胞X染色体上PIG－A基因发生突变，引起糖基磷脂酰肌醇锚合障碍，导致GPI锚链蛋白(GPI－AP)表达减少或者缺失，使得异常细胞对补体敏感而被破坏，出现持续性血管内溶血[9]。而传统诊断PNH的方法有赖于一系列特殊的溶血试验检测，糖水试验试验敏感性高，但特异性差，只能用于初步筛查；Ham试验特异性高，但敏感性差，PNH患者中阳性率只有60%～80%[10]，是否阳性取决于PNH患者对补体敏感的异常红细胞数量，只有PNH患者外周血受累红细胞数量达到一定比例才有可能阳性。近年来应用流式细胞术检测CD55、CD59抗体标记已成为临床诊断PNH的一个新的特异手段。其具有敏感性高，特异性强、结果准确、重复性高等特点，结合特异性单抗，可同时检测细胞表面两种主要GPI锚定蛋白的缺失，并能发现少量PNH克隆，有报道称应用流式细胞术可检测出仅占3%的异常细胞存在[11]。因此，通过检测细胞表面CD55、CD59的缺乏可以作为诊断PNH最直接的证据。

目前已经证实PNH克隆可累及几乎所有的血细胞[12]，不同系列细胞表面的CD55、CD59缺乏或减少的程度不一，其累及造血细胞次序为粒细胞、单核细胞、红细胞、淋巴细胞[13]。有报导指出PNH患者出现严重溶血，刚刚接受输血治疗或正处于恢复期时。因为红细胞寿命较长，异常细胞被破坏和正常细胞增多会导致异常细胞相对减少，因此若只检测红细胞的CD55－、CD59－可能出现假阴性[14]。本实验结果表明，所有健康人红细胞和粒细胞CD55－、CD59－的百分比均小于5%；7例PNH患者中，Ham试验2例阴性，尿Rous试验1例阴性，而其红细胞和粒细胞CD55－、CD59－的百分比均大于5%，存在PNH克隆，检出率为100%。这说明CD55、CD59检测的敏感性要明显优于Ham试验、尿Rous试验，提示CD55－和CD59检测可以用于PNH早期诊断及鉴别诊断；另外，糖水试验中除了7例PNH患者阳性外，我们发现有6例AA患者也被检测出阳性，容易出现假阳性而做出误诊，而20例AA患者中除一位患者红细胞和粒细胞CD55－、CD59－的百分比均大于5%，小于10%外，均没有检测出PNH克隆，这说明CD55、CD59检测的特异性要好于糖水试验。我们后期跟踪发现这位AA患者最终转化为PNH，证实了AA和 PNH关系密切，部分AA患者可以转化为PNH[15]。同时我们在2例IDA患者红细胞上也检测出了少量PNH克隆，其程度比PNH患者轻，而粒细胞正常，其机制目前尚不清楚。

综上所述，利用流式细胞术同时检测外周血中红细胞和粒细胞CD55和CD59的表达对PNH的诊断具有无可比拟的优势，利于PNH的早期发现，是目前诊断PNH最敏感的方法。

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·实验研究·

The application of CD55 and CD59 expression in the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria syndrome

WU Qiong，WANG Xiaozhong. Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.

Abstract：Objective To study on the application of CD55 and CD59 expression detected by flow cytometry in the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria syndrome (PNH). Methods Flow cytometry was used to detect the expression of the peripheral erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 in anemia patients and healthy control group，and at the same time doing Ham test，sugar intake test and urine Rous test were done. Results The expression of the erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 in healthy control group were less than 5%. Seven PHN patients’expression of the erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 were more than 5%. Two of the twenty AA patients’expression of the erythrocytes surface antigen CD55，CD59 was more than 5%，and only one of them the expression of the erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 were all more than 5%. Part of the IDA patients’expression of the erythrocytes surface antigen CD55，CD59 were more than 5%，while the expression of the granulocytes is normal. MA and AIHA patients’expression of CD55，CD59 were normal. In the seven PHN patients，two of them Ham test were negative，one of them urine rous test was negative，but all of them the the expression of the erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 were more than 5%. Conclusion Using flow cytometry to detect the expression of the peripheral erythrocytes and granulocytes surface antigen CD55，CD59 has unexampled advantages in the diagnosis of PNH，and it has been helpful and the most sensitive method to the early detection of PNH.

Key words:PNH；CD55；CD59；Flow cytometry

(收稿日期2015－12－09；修回日期2016－02－03)

通信作者：王小中，男，1973年12月生，博士，研究生导师，主任技师，教授，研究方向：主要从事临床检验诊断学。

基金项目：江西省自然科学基金项目，项目编号：2014ZBAB205010

作者简介：吴琼，女，1984年6月生，硕士学位，主管技师，研究方向：流式细胞术。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.02.006

中图分类号：R556.6+4，R446.62

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)02-0146-03