急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因检测的临床意义

刘小宁，李元媛，甘宜敏，陈凤丽，衡春，于亮

(南京医科大学附属淮安市第一人民医院中心实验室，江苏淮安223300)



急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因检测的临床意义

刘小宁，李元媛，甘宜敏，陈凤丽，衡春，于亮

(南京医科大学附属淮安市第一人民医院中心实验室，江苏淮安223300)

摘要:目的探讨荧光原位杂交技术（FISH）检测PML/RARα融合基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）诊断中的应用价值。方法应用常规细胞遗传学分析28例APL患者的染色体核型，同时用FISH法检测PML/RARα融合基因。结果28例初诊的APL患者254例常规核型分析检出t(15；17)（q22；q12）；2例患者核型正常；另1例未检出t(15；17)，核型分析结果为涉及15和17号染色体的复杂异常；FISH检测所有病例均存在PML/RARα融合基因。结论FISH法行PML/RARα融合基因检测特异性和敏感性好，是诊断APL的可靠方法。

关键词：急性早幼粒细胞白血病；PML/RARα融合基因；荧光原位杂交技术（FISH）；染色体

急性早幼粒细胞白血病（APL）是急性白血病中的一种特殊类型，其临床特点是出血倾向严重，常易并发DIC及原发性纤溶亢进，早期病死率高，所以，APL早期诊断和及早治疗至关重要。现已明确，t(15；17)是APL特征性染色体异常，并在分子水平上导致PML/RARα融合基因形成[1]。为进一步明确临床上表现为APL特征的患者，我们经过对住院治疗的28例APL患者进行染色体和PML/ RARα融合基因的检查，以探讨他们在APL诊断中的应用价值。

1　材料与方法

1.1对象一般资料选取2009年1月至2011年3月在我院血液科初诊的28例APL患者，其中男16例，女12例，年龄14～82岁，平均年龄39.6岁。所有患者初诊时均有临床症状，并经细胞形态学、免疫学及组化染色初步诊断为APL。正常对照选用5例血液系统正常者的骨髓标本。

1.2方法

1.2.1染色体核型分析取治疗前患者和正常对照组的骨髓细胞（肝素抗凝），采用直接法和24h短期培养法培养细胞，按常规方法收获细胞，用R显带进行核型分析，染色体异常按《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2005ISCN2013）》的有关规定加以描述[2]。剩余细胞悬液冻存于－20℃冰箱內以供FISH检测。

1.2.2荧光原位杂交（FISH）检测

1.2.2.1融合基因探针双色融合（PML/RARα）探针购自Vysis公司，－20℃保存备用。PML和RARα分别应用SpectrumOrange和SpectrumGreen两种荧光素标记。

1.2.2.2杂交取储存于－20℃的骨髓细胞悬液，更换新鲜的甲醇/冰醋酸（3：1）固定液，滴片，晾干，过夜老化。加探针混合物，盖片，封胶，置杂交仪湿盒中变性杂交。变性：72℃，2min；杂交：37℃，16～24h。次日将杂交后标本依次浸入72℃0.4×SSC、2×SSC/ 0.1%NP40中漂洗，避光晾干后加DAPI复染，封片。

1.2.2.3荧光显微镜检查应用荧光显微镜在DAPI/FITC滤色镜的激发下观察间期细胞的荧光杂交信号。正常细胞为：2个红色2个绿色彼此分离的4个荧光信号；伴有t(15；17)染色体易位的细胞核中可见1个红色、1个绿色和2个黄色融合信号；正常对照组取值方法参考有关文献[3，4]，以大于x+3s作为阳性标准，PML/RARα的阳性标准为＞2.56%。每例至少分析200个细胞，计算阳性细胞百分比。

2　结果

2.1染色体核型分析结果染色体分析28例患者中25例检出t(15；17)，阳性率为89.3%；2例染色体核型结果正常；另1例未检出t(15；17)，但核型分析为涉及15和17号染色体的复杂异常核型。对照组5例核型分析结果均正常。见（表1、图1。）

表1　28例APL患者与对照组核型

图1　核型分析结果图

2.2 FISH检测结果28例APL患者经FISH检测均发现有PML/RARα融合基因存在。见表2、图2。

3　讨论

APL是一种特殊类型的白血病，具有相对特异的形态学特征及细胞分子遗传学特征，其形态特征为胞浆含有大量颗粒的异常早幼粒细胞，细胞分子遗传学特征为染色体检查可见特异的t(15；17)，该易位导致17q的维甲酸受体α（RARα）基因与位于15q上的早幼粒细胞白血病（PML）基因融合，形成了PML/RARα融合基因，后者产生的PML/RARα融合蛋白通过一系列信号途径，使造血干细胞分化阻断在早幼粒阶段而发生白血病转化[5]。

表2　FISH法检测PML/RARα

图2　FISH检测结果图

以往APL的诊断通常依靠细胞形态学及常规染色体检查，但由于骨髓早阶段细胞形态有相似之处，且少数变异型APL（M3v）形态学不典型，因此形态学有时难以诊断APL；常规染色体检测也是常用的手段，约85%的APL可检出t(15；17)，然而临床上仍有15%左右的病例由于核型分析的中期细胞数量少、质量差或15；17隐匿性及变异型易位而导致t(15；17)漏检[6]。我们总结28例APL患者，有89.3%的患者通过常规染色体核型分析检出t(15；17)，与文献报道结果相似[7]；28例APL中有2例患者的核型正常，另1例APL的核型分析未检出t(15；17)，只检测到涉及15号和17号异常的复杂核型，但其临床症状和细胞形态学支持APL的诊断，染色体核型结果不能排除15；17隐匿性及变异型易位。由此可见常规细胞遗传学结果并不能全面反映APL群体，核型分析有时难以肯定是否伴有特征性分子异常，因此我们对上述标本进行了分子生物学的检测。

分子检测手段包括RT－PCR、Southern杂交、Northern杂交、FISH等技术。临床上检测PML/ RARα常用荧光定量RT－PCR技术[8]R，T－PCR技术其尽管敏感性高，但易出现假阴性和假阳性，引物的设计也影响检出[9，10]。Southern和Northern杂交技术操作过程繁琐，不适宜常规临床检测。FISH技术是近年来发展起来的一种较理想的快速、可定量检测方法，在本组研究中的初诊APL患者PML/RARα融合基因检出率为28/28（100%），高于常规核型的阳性检出率24/28(89.3%)，核型检出t (15；17)的25例患者PML/RARα融合基因均阳性；本组的2例核型正常患者PML/RARα融合基因亦为阳性，表明他们是隐匿性t(15；17)易位的APL；另1例累及15、17号染色体的复杂核型经FISH检测除PML/RARα融合基因阳性外，发现易位还涉及15、17号之外的第3条染色体，提示不典型的FISH信号模式的患者存在更为复杂的遗传学异常[11]。结果提示其为复杂变异易位。由此可见FISH法检测PML/RARα融合基因的敏感性及特异性均优于常规细胞遗传学，尤其对于核型检测正常和具有复杂变异易位的病例起到了明确诊断的作用[12]。

临床上凡具有t(15；17)易位或有PML/RARα融合基因的APL对维甲酸和砷制剂治疗有效，但还有少数APL患者伴有变异型染色体易位如t(5；17)，t (11；17)等，这类患者对维甲酸治疗反映差[13，14]，故准确检测t(15；17)易位和PML/RARα融合基因对于APL诊断、指导治疗有重要的指导作用，鉴于FISH法检测t(15；17)易位形成的PML/RARα融合基因高灵敏度，在APL的诊断中具有重要价值，而染色体核型分析和FISH两种检测方法同时应用具有一定的互补性[15]。而PML/RARα融合基因在APL的预后判断及治疗效果方面的意义还值得我们进一步研究。

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·论著·

Clinical significance of detecting PML/RARα fusion gene in acute promyelocytic leukemia

LIU Xiaoning，LI Yuanyuan，GAN Yimin，CHEN Fengli，HENG Chun，YU Liang，et al. Central Laboratory，No.1 Hospital of Huai’an，Nanjing Medical University，Huai’an Jiangsu 223300，China.

Abstract：Objective To explore the application value of detecting PML/RARα fusion gene in the diagnosis of acute promyelocytic leukemia(APL) with fluorescence in situ hybridization(FISH). Methods The chromosome karyotype of 28 cases of APL patients was analyzed with the conventional cytogenetic analysis method and the PML/RARα fusion gene was detected with FISH method. Results Among 28 first diagnosed APL patients，the t (15；17)(q22；q12) was detected in 24 25 patients with the conventional karyotype analysis；Two patients were detected to be normal karyotype；And the t (15；17) was not detected in one case. The karyotype analysis results showed the complex abnormalities involving in the chromosome 15 and 17；The PML/RARα fusion gene was detected to exist in all cases with FISH detection. Conclusion The PML/RARα fusion gene detection with FISH method is a reliable way for the diagnosis of APL with fine specificity and sensitivity.

Key words:Acute promyelocytic leukemia；PML/RARα fusion gene；Fluorescence in situ hybridization(FISH)；Chromosome

(收稿日期2014-08-22；修回日期2016-03-15)

作者简介：刘小宁，女，1969年2月出生，副主任技师，医学学士，临床检验专业。研究方向：血液学基础实验诊断。

基金项目：江苏省自然科学基金项目，编号：BK20141254。

DOI：10.3969/j.issn.1674－1129.2016.02.004

中图分类号：R733.71，R446.62

文献标识码：A

文章编号：1674－1129(2016)02－0140－03