基于p21启动子报告基因系统的构建及应用

李继友（天津渤海职业技术学院，天津300400）

基于p21启动子报告基因系统的构建及应用

李继友
（天津渤海职业技术学院，天津300400）

本研究通过构建p21启动子报告基因系统，进行筛选能够上调p21表达的有效中药制剂，最终阐明其基本抗肿瘤机理。

启动子；报告基因系统；构建

p21基因是重要的肿瘤抑制基因p53的靶基因，在细胞受内外环境胁迫的情况下，转录因子p53蛋白表达量升高，p53可以调节大量蛋白的表达，从而使细胞周期阻滞在G1/S期。p21可以以p53依赖和非依赖的方式表达升高，p21可以结合细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2和CDK4/6，抑制细胞周期进程。多种放疗和化疗药物治疗肿瘤的机制就是诱导肿瘤细胞内p21表达升高，进而抑制细胞增殖，从而抑制肿瘤生长。

中药是我们国家的瑰宝，许多药物已经被用于治疗不同类型的肿瘤，取得了良好的效果。但是其治疗肿瘤的机制不明，限制了其应用和发展。我们构建了p21启动子报告基因系统，用于筛选能够上调p21表达的有效中药制剂，进而阐明其抗肿瘤机理。

1材料与方法

1.1主要试剂

DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Hy⁃clone公司），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司），G418（Calbiochem公司），反转录试剂盒及荧光素酶单报告检测系统试剂盒（Promega公司），PCR反应中的Premix ExTaq和DNA Marker（Takara公司）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

本论文中所用到的细胞系包括人胚肾细胞系293和宫颈癌细胞HeLa均购于中国科学院上海细胞研究所细胞库。细胞用含10%胎牛血清、100μ g/ mL链霉素的DMEM（Hyclone）培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养，采用含0.02%EDTA的胰酶消化细胞并进行传代[1]。

1.2.2质粒构建

WWP-Luc-1由Vogelstein博士(Johns Hopkins University, Baltimore, MD)提供[2]，它包含有2.3kb的p21启动子片段，利用HindIII单酶切后连入pGL3-Enhancer载体上。然后用BglII和XbaI将该载体上的p21启动子和荧光素酶基因酶切后连接到pCI-neo载体上。纯化后的得到pCI-p21-luc-neo用于转染（如图1）。

图1 pCI-p21-luc-neo质粒图谱

1.2.3细胞转染及筛选

24孔板中每孔加入500μLDMEM培养基，接种5× 104个293细胞，于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。采用Lipofectamine2000分别转染pCI-p21-luc-neo，每孔加入100μL脂质体-质粒转染混悬液（含质粒DNA 0.4μg，Lipofectamine 2000 1μL），继续培养24h。然后胰酶消化，转移至10cm培养皿中；每皿加入含0.5mg/ mLG418的DMEM培养基；继续培养5d后，更换含G418的新鲜培养基继续培养得到单克隆[2]。

1.2.4荧光素酶报告基因检测

应用荧光素酶单报告检测系统试剂盒来检测。利用Turner Designs TD20/20光度计的单荧光素酶实验系统模式来测定荧光素酶活性。用裂解液裂解细胞，加入荧光素酶的底物并检测其活性。实验结果均为3次独立实验结果的平均值。所有结果均以平均值±标准差(mean±SD)表示。

1.2.5总RNA提取及反转录PCR

利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取总RNA，并利用Promega公司的反转录试剂盒进行反转录PCR，得到cDNA。

1.2.6 PCR及琼脂糖凝胶电泳

以上述cDNA为模板，p21特异性引物（sense：5 ’- GGATGTCCGTCAGAACCC- 3’；antisense：5’-GCTCCCAGGCGAAGTCA-3’）和β-actin特异性引物（sense: 5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’；an⁃tisense：5’-ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3’）进行PCR反应，反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。

2实验结果

2.1 p21启动子报告基因系统的建立和鉴定：我们筛选到了稳定转染p21启动子的293细胞（293-p21），然后对该细胞进行鉴定。根据文献报道，去乙酰化酶抑制剂TSA，中药甘草次酸均可以有效的诱导p21的表达。我们发现，用这两种药物处理293-p21细胞24h后，利用荧光素酶报告基因检测，与对照相比，两种药物均可以显著诱导p21的启动子活性（图2）。证明我们成功构建了药物筛选的系统。

图2

2.2筛选有效上调p21启动子活性的中药：我们利用构建的293-p21筛选系统，对多种可能具有抗肿瘤活性的中药进行了检测。我们用不同浓度的中药处理细胞，24h后进行荧光素酶报告基因检测，我们成功的检测到中药2号可以在低浓度的条件下显著诱导p21的启动子活性（图3）。表明中药2号可能通过上调p21水平发挥功能。

图3

2.3阳性药物上调p21 mRNA水平：为了进一步确定我们所筛选到的药物可以上调p21水平，我们用中药2号和TSA分别处理肿瘤细胞HeLa，24h后提取细胞的总mRNA进行反转录，利用得到的cDNA为模板，p21基因特异性引物进行扩增，我们发现和阳性对照药物TSA一样，中药2号可以显著上调肿瘤细胞中p21 mRNA的表达（图4）。

图4

3 讨论

我们成功构建了一个基于p21基因启动子的稳定转染细胞系，由于p21是多种胁迫抑制细胞增殖的效应基因，很多的肿瘤药物均可以诱导p21的表达。我们得到的系统经过验证，可以有效地被已知的抗肿瘤药物进行诱导，证实该系统可以作为筛选阳性药物的有效工具。

中药及中药制剂已经被越来越多的用于各种疑难杂症例如肿瘤的治疗，并取得了良好的疗效。但是在靶向治疗、精准医疗的大环境下，由于其成分复杂，作用机制不清等原因，局限了中药的应用。我们所得到的筛选系统可以有效的筛选通过p21途径抑制细胞增殖的中药，为进一步研究其作用机制奠定了基础。

我们利用该筛选系统，成功的筛选到一个中药可以有效的诱导p21启动子活性，同时可以在mRNA水平诱导p21的表达，我们还将进一步对该药物进行分离纯化，得到更有效的单体成分，并用于肿瘤的治疗。

［1］卢圣栋.现代分子生物学实验技术（第二版）[M].北京：中国协和医科大学出版社, 1999.

［2］J.萨姆布鲁克,拉塞尔主编, D W,黄培堂等译.分子克隆实验指南第三版[M].北京：科学出版社, 2002.

10.3969/j.issn.1008-1267.2016.02.006

R730

A

1008-1267（2016）02-0017-03

2015-12-20

李继友（1961－）男，副教授，高级工程师，主要从事化工专业教学与科研管理工作。