HPLC法同时测定承德山里红叶中绿原酸和牡荆素鼠李糖苷的含量

杜义龙，潘海峰

(承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德　067000)



HPLC法同时测定承德山里红叶中绿原酸和牡荆素鼠李糖苷的含量

杜义龙，潘海峰

(承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德067000)

[摘要]目的：建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定承德地区山里红叶中绿原酸和牡荆素鼠李糖苷的含量。方法：采用AgiLent ZORBAX SB-C(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；以乙腈-0.1%甲酸水溶液-四氢呋喃为流动相梯度洗脱；检测波长为340 nm；检测时间50 min；流速1.0 mL·min(-1)；柱温30℃；进样量10 μL。结果：15批承德山里红叶样品中绿原酸和牡荆素鼠李糖苷的线性范围分别为2.56～410、2.51～400 mg·L(-1)(r分别为0.999 9，0.999 8)；平均加样回收率分别为99.8% (RSD 0.48%)，99.7% (RSD 0.77%)。结论：该方法准确可靠，重现性好，可用于山里红叶的质量控制。

[关键词]山里红叶；高效液相色谱法；绿原酸；牡荆素鼠李糖苷

山里红叶为蔷薇科植物山里红(Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.)的干燥叶，是山楂叶的一种，主产于河北承德、山东、山西和辽宁等地[1,2]。具有理气通脉、活血化瘀、化浊降脂之功效[3]。2010版中国药典在含量测定项下，采用HPLC法测定山楂叶中金丝桃苷的含量以控制山楂叶的质量。近年来，本实验室对山楂叶及其制剂进行了系统研究[4-7]，发现山楂叶化学成分复杂，主要含有牡荆素鼠李糖苷等黄酮类化合物和绿原酸等有机酸类化合物[8]，而金丝桃苷在山楂叶中含量较低，牡荆素鼠李糖苷和绿原酸在山楂叶中含量较高[5]，本文通过色谱条件的优化，采用HPLC法同时测定山里红叶中牡荆素鼠李糖苷和绿原酸的含量，以期为山楂叶质量标准的提高提供理论依据。

1材料与试药

1.1仪器

安捷伦1200系列液相色谱仪(G1322A 在线脱气机、G1311A 二元泵、G1316A 柱温箱、G1315D二极管阵列检测器、G1329A自动进样器)；安捷伦Chemstation色谱工作站；梅特勒-托利多1/10万AG-245型电子分析天平，KQ-700型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，功率700 W，频率40 KHz)，HC-2062高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)。

1.2试药

对照品：绿原酸(中国药品生物制品鉴定所，批号：110753-200413)、牡荆素鼠李糖苷(中国药品生物制品鉴定所，批号： 111668-200602)对照品纯度均大于99%；甲醇、乙腈、四氢呋喃均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂为分析纯。

药材：山里红叶由承德民族师范学院董建新教授鉴定为蔷薇科山楂属植物山里红的干燥叶，药材来源及采集时间见表1。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，C为四氢呋喃；梯度程序见表2；检测波长340 nm；流速1.0 mL·min-1；柱温30℃；进样量10 μL。

表2　山里红叶流动相梯度程序

2.2对照品溶液的制备

精密称取牡荆素鼠李糖苷4 mg、绿原酸4.1 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成每1 mL含牡荆素鼠李糖苷0.4 mg、绿原酸0.41 mg的混合对照品溶液。混合对照品溶液色谱图见图1。

图1　混合对照品溶液的HPLC色谱图

2.3供试品溶液的制备

将去除杂质的山里红叶置于烘箱，60℃下干燥至恒重(约3 h)，用粉碎机粉碎；取山里红叶粉末(过60目筛)约0.5 g，置具塞三角瓶中，加入70%的甲醇溶液25 mL，称重；超声提取30 min，冷却至室温，称重，补足重量；过滤，续滤液过0.45 μm滤膜，即得。供试品溶液色谱图见图2、阴性对照溶液色谱图见图3。

图2　供试品溶液的HPLC色谱图

图3　阴性对照溶液HPLC色谱图

2.4含量测定

2.4.1线性关系考察以2.2中混合对照品溶液作为1号溶液，然后采用倍比稀释法制成系列浓度的溶液，得2，3，4，5，6号混合对照品溶液。按照2.1项下色谱条件测定，记录峰面积以对照品浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果绿原酸的回归方程为Y=15 336X-15.491(r=0.999 9)，线性范围为2.56～410 /mg·L-1；牡荆素鼠李糖苷的回归方程为Y=15 404X-50.894(r=0.999 8)，线性范围为2.51～400/mg·L-1。

2.4.2精密度试验精密吸取同一药材(S1)供试品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积，结果绿原酸峰面积的RSD为0.5%，牡荆素鼠李糖苷峰面积的RSD为0.9%。

2.4.3重复性试验取药材粉末(S1) 6 份，按2.3项下方法操作制备供试品溶液，分别进样，按2.1项下色谱条件测定，结果绿原酸含量的RSD 为1.2%，牡荆素鼠李糖苷含量的RSD 1.85% 。

2.4.4稳定性试验取同一药材(S1)，按2.3项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样，按2.1项下色谱条件测定，结果绿原酸峰面积的RSD为0.8%，牡荆素鼠李糖苷峰面积的RSD为1.0%，表明供试品在24 h内测试稳定。

2.4.5加样回收率试验精密称定已知绿原酸和牡荆素鼠李糖苷含量的同一批山里红叶药材(S1) 6份，每份约0.25 g，分别加入2种对照品适量，按2.3项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定峰面积，由回归方程计算样品中绿原酸和牡荆素鼠李糖苷的含量，回收率的测得量见表3。

表3　2种成分的回收率测定结果

2.4.6含量测定分别精密称量15批药材各0.5 g，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1色谱条件进行测定，每份样品平行测定3次，依次测定各批样品，计算各指标成分含量，见表4。

表4　山里红叶2种成分的含量(n=3)

3讨论

3.1提取条件的优选

本研究分别考察了提取方法、溶剂种类和提取时间对山里红叶提取效果的影响。3种提取方法中, 索氏提取和回流提取溶剂消耗量较大,提取时间较长。而相比之下超声提取操作简单且提取充分。通过实验发现，70%甲醇超声提取30 min，提取效果较好，缩短提取时间提取不充分，延长提取时间，对提取效果无明显改变。

3.2色谱条件的优化

在前期研究的基础上，本文进一步优化色谱条件，最终采用本文的色谱条件，在分离度不受影响的基础上，简化了流动相体系，固定了检测波长，大大缩短了检测时间，提高了检测的效率。

本文对 15 批山里红叶样品同时进行牡荆素鼠李糖苷和绿原酸的含量测定， 不同批次间2个成分的含量相差较大，这有可能是不同产地的药材种植不规范造成的，所以加强中药种植生产的全方位管理对提高中药质量具有重要意义。

[参考文献]

[1]陈忠,卢树杰,张维库,等.HPLC测定山楂叶总黄酮中牡荆素鼠李糖苷含量[J].中成药,2009,31(10):1615.

[2]郝近大.实用中药材经验鉴定[M].北京:人民卫生出版社,2001.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010.

[4]王领弟,李艳荣,张晓峰,等.山楂叶指纹图谱研究[J].中国实验方剂学杂志，2011,17 (19):74-77.

[5]杜义龙,李艳荣,张晓峰,等.承德产山楂叶的HPLC指纹图谱研究[J].中国现代应用药学，2012,29(10):906-910.

[6]潘海峰,王领弟,李艳荣,等.HPLC法同时测定山玫胶囊中8个成分的含量[J].药物分析杂志，2012,32(11):1962-1967.

[7]王肖,杜义龙,赵胜男,等.承德产山楂叶中总黄酮和5 种黄酮类成分含量的动态分析[J].中国实验方剂学杂志，2013,19(17):171-175.

[8]刘荣华,余伯阳.山里红叶化学成分研究[J].中药材,2006,29(11):1169-1173.

本文编辑：王知平

Determination of ChLorogenic Acid and Vitexin Rhamnoside in Major Hawthorn Leaf of Chengde by HPLC

DU Yilong，PAN Haifeng

(ChengdeMedicalCollege,TraditonalChineseMedicineResearchandDevelopmentLab.inHebei,Chengde067000，Hebei,China)

[ABSTRACT]Objective: To develop HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and vitexin rhamnoside in Major Hawthorn Leaf of Chengde.Method: With an Agilent ZORBAX SB-C(18) column(4.6 ×250 mm,5 μm), gradient elution was performed by mobile phase of 0.1% formic acid-acetonitrile -tetrahydrofuran.The detection wavelength was 340 nm;detection time was 50 min; fLow rate was 1.0 mL·min(-1); the column temperature was 30℃; injection volume was 10 μL.Results: In the 15 batches of Major Hawthorn Leaf of chengde, the Linear ranges of chlorogenic acid and vitexin rhamnoside were from 2.56～410 mg·L (-1) (r=0.999 9) to 2.51～400 mg·L(-1) (r=0.999 8), respectively.The average recovery rates of chlorogenic acid and vitexin rhamnoside were 99.8% (RSD 0.48%),99.7%(RSD0.77%),respectively.Conclusion: This method is accurate, reproducible and suitable for controlling the quality of Major Hawthorn Leaf.

[KEYWORDS]Major Hawthorn Leaf; High-performance Liquid Chromatography; Chlorogenic Acid; Vitexin Rhamnoside

[中图分类号]R917

[文献标识码]A

[文章编号]1671-0126(2016)01-0004-04

[作者简介]杜义龙，男，助教，从事中药质量标准研究工作