高效毛细管电泳法快速测定乳铁蛋白原料的纯度

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特011500）

高效毛细管电泳法快速测定乳铁蛋白原料的纯度

刘宇，陈伟，史玉东，李志伟，高增丽，侯慧敏，陈云

（内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司，呼和浩特011500）

建立了动态涂层毛细管电泳快速检测乳铁蛋白含量的方法。并运用该方法对不同乳铁蛋白原料的纯度进行了检测。经检测4种乳铁蛋白原料的纯度分别为乳铁蛋白A91.05%，乳铁蛋白B93.62%，乳铁蛋白C94.38%，乳铁蛋白D75.81%；相对标准偏差（RSD）分别为1.0%，0.8%，1.2%，0.9%。并与供应商所提供的原料纯度进行比较，讨论了造成二者之间略微差异的原因。结果表明，该动态涂层方法能够有效抑制毛细管内壁对乳铁蛋白的吸附，对于乳铁蛋白的检测及纯度的验证十分有效，为此类蛋白的检测提供了一种手段。

高效毛细管电泳；动态涂层；乳铁蛋白；纯度

0 引 言

牛乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种具有多种生物学功能的非血红素铁结合糖蛋白，主要由乳腺上皮细胞表达和分泌[1]。其分子量约为80 ku，等电点为8.0± 0.2，结构与血清转铁蛋白、血浆或乳浆中的转铁蛋白很相似，但是Lf的铁亲和能力是他们的260倍[2]。乳铁蛋白具有许多特殊的生理活性，既能参与铁的转运，又能调节免疫系统，同时具有抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等功能[3]。许多乳制品公司把乳铁蛋白作为一种重要的功能性原料，添加到婴幼儿配方奶粉、儿童奶等高附加值的产品中[4，5]。

目前乳铁蛋白检测方法有酶联免疫法[6]、放射免疫扩散法[7]、表明等离子共振技术[8]、液相色谱法[9]、分光光度法[10]、毛细管电泳法[11]。不同的检测方法，精确度、检出限以及成本等条件各有不同。本试验从实际应用角度出发，采用动态涂层法处理石英毛细管柱，为有效防止蛋白质在毛细管内壁的吸附，提高检测准确性、缩短检测时间，降低检测成本。

1 实 验

1.1 仪器及试剂

（1）仪器。P/ACE MDQ型毛细管电泳仪并配有紫外检测器，Millipore Milli-Elix/RiOs型超纯水仪，Z-36HK台式高速冷冻离心机，VORTEXGEMIE2漩涡混合器，1875D超声波清洗机，精密pH计，万分之一天平，未涂层石英毛细管柱（型号为Capillary Tubing-50μm I.D，375μm O.D）。

（2）试剂。氢氧化钠(分析纯)，甲醇（色谱纯），三羟甲基氨基甲烷（优级纯），戊二胺（优级纯），十六烷基三甲基溴化铵（优级纯），聚乙二醇（优级纯），硼酸(优级纯)，尿素（分析纯），羟丙基甲基纤维素（分析纯），乙二胺四乙酸二钠（分析纯），乳铁蛋白标准品（LF≥96%，HPLC）。

（3）乳铁蛋白原料。乳铁蛋白A（纯度95%），乳铁蛋白B（纯度95%），乳铁蛋白C（纯度95%），乳铁蛋白D（纯度80%）。

1.2 方法

1.2.1 未涂层毛细管的活化

截取内径为50μm，总长度为800 mm（有效长度为700 mm）的未涂层石英毛细管柱，用色谱级甲醇冲洗15 m in，去离子水冲洗15 m in，浓度为1 m oL/L的NaOH冲洗15 m in，静置20 m in，然后用去离子水冲洗15m in。

1.2.2 未涂层毛细管内壁动态涂层过程

（1）动态涂层试剂的配制。用去离子水准确配制100 m L动态涂层试剂，使得各成分浓度为三羟甲基氨基甲烷200 mm ol/L，戊二胺60 mm ol/L，十六烷基溴化铵120 mm ol/L，聚乙二醇80 mm o l/L，用浓度为0.1 m ol/L的N aOH调节pH值至9.0。

（2）缓冲溶液的配制。用去离子水准确配制100 m L缓冲溶液，使得各成分浓度达到如下：硼酸50 mm ol/L，尿素6 mo l/L，戊二胺60 mmo l/L，十六烷基溴化铵120 mm ol/L，羟丙基甲基纤维素0.05%，用浓度为0.1 m o l/L的NaOH调节pH值至9.0。

（3）动态涂层。用浓度为0.1 m ol/L的N aOH冲洗毛细管内壁3 m in，去离子水冲洗3 m in，动态涂层试剂冲洗3 m in，静置5 m in，缓冲溶液冲洗3 m in，按照以上步骤循环3次。

1.2.3 标准曲线的绘制及原料的测定

（1）乳铁蛋白标准溶液的配制。准确称取10 m g乳铁蛋白于2m L塑料离心管中，然后加入1m L去离子水，漩涡振荡至充分溶解，静置1 h，然后依次梯度稀释至5，2.5，1.25，0.625 g/L（均为质量浓度）。

（2）检测设备参数的确定。检测器为紫外光检测器、检测波长为200 nm，检测温度为30℃，进样方式为压力进样，压力为3.448 kPa，进样时间为15 s，工作电压为25 kV，采集频率为8 H z。

（3）进样前毛细管的处理。新毛细管首次可直接进样；下次进样前，依次分别用浓度为0.1 m o l/L的NaOH、动态涂层试剂、缓冲溶液清洗3m in后方可进样。

（4）标准曲线的绘制。将不同浓度的乳铁蛋白标准溶液依次上样，得到不同浓度下的峰面积，外标法定量，建立浓度与峰面积之间对应关系的标准曲线。

（5）原料纯度的测定。分别准确配制质量浓度为5.0 g/L乳铁蛋白溶液。在最佳电泳条件下，分别对样品中进行测定：每个样品待测液重复进样5次，计算出峰面积平均值，带入标准曲线计算得乳铁蛋白质量浓度。

2 结果与分析

2.1 动态涂层试剂的选择

缓冲溶液中加入涂层物质形成动态涂层时，可用作选择的涂层物质包括：两性离子、单胺、低聚胺、表面活性剂、中性的或带电荷的聚合物[12]。一般地讲，这些化合物与毛细管壁之间有强烈的相互作用，因此可以动态的涂敷在毛细管表面。添加物的性质决定了其与毛细管壁之间的相互作用可以是库仑引力、氢键或者范德华力[13]。毛细管内壁经氢氧化钠解离后，呈现带负电的硅羟基。本文在三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液中加入十六烷基溴化铵，二者直接存在氢键，在烷基链和硅氧烷基团之间存在疏水性相互作用，因此形成稳定的涂层。同时加入戊二胺、聚乙二醇能够对硅羟基产生静电吸引从而影响电渗流，改善分离。减少蛋白质在内壁的吸附。此外，缓冲溶液中加入羟丙基甲基纤维素也是防止在分离过程中硅羟基内壁的解离[14]，其乳铁蛋白电泳图谱如图1所示。

图1 不同成分动态涂层试剂乳铁蛋白电泳图谱

2.2 缓冲液、pH值的选择

乳铁蛋白的分子量为80 ku，等电点为（p I），为碱性蛋白。因此，可以使分离缓冲液的pH值高于其等电点，使其带负电，与毛细管内壁表面一致，从而减少蛋白吸附。由于乳铁蛋白为糖基化蛋白，易与硼酸根形成带负电的络离子，从而进一步增加与毛细管内壁的库伦排斥力，因此分离缓冲体系选用硼酸盐体系可减少吸附[15]。另外，高浓度硼酸盐还可提高分离效率，然而，硼酸盐的浓度过高会产生较多的焦耳热，引起色谱峰展宽，通过试验硼酸的最佳浓度为0.5 mol/L。因为硼酸的紫外吸收波长为180 nm，而乳铁蛋白的吸收波长为200 nm，pKa值是9.24，其缓冲范围在8.24～10.24之间，试验发现随着pH值的增加，分析物的分离时间延长，分离度增加，但是pH值增加会带来过高的离子强度，从而使电渗流增加，焦耳热增多，最后导致峰展宽、灵敏度下降。因此，最终确定最佳pH值为9.0，如图2所示。

图2 不同pH值条件下乳铁蛋白电泳图谱

2.3 检测电压、温度的选择

毛细管柱长度确定时，随着分离电压的增大，电渗流和电泳迁移速度的绝对值都增大，分离时间缩短，分离效率和分离度增加，但也会产生过量的焦耳热，如果这些热量不能及时散失，则纵向温度梯度增大，从而导致分离效率和分离度下降[16]。因此电泳速度通常在不产生过多焦耳热的前提下，使用尽可能高的分离电压，实现最大分离度和最短分析时间。本试验证明，在电压增加过程中，蛋白峰型、分离效果均未受到影响，且分离时间缩短，因此选择30 kV为最佳运行电压，如图3所示。

电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效果。温度过高，会使毛细管内的溶液过热而沸腾，甚至于击穿，故温度越低越好。由于温度每改变l℃，将改变黏度2%～3%，因此影响电渗。温度不恒定，波动大，会导致重现性不好，顾有必要在毛细管柱系统内进行恒温。实际测定中，适度的升高温度，使缓冲液的浓度减小，淌度增加，会减少迁移时间[17]。由于本文采用的是动态涂层法，温度过高会对涂层的影响较大，影响分离效率，此外试验仪器有一定的降温功能，经试验发现25℃分离效果最好。

图3 不同电压条件下乳铁蛋白电泳图谱

2.4 标准曲线、线性范围、精密度及检出限

将质量浓度分别为0.625，1.25，2.5，5，10 g/L的乳铁蛋白标准品溶液依次分别进样，得到不同质量浓度乳铁蛋白电泳图（图4）；然后对峰面积进行积分，分别为212482，409297，901800，1995024，4029240；利用仪器自带分析软件计算出标准曲线，其线性回归方程为y=2×10-6x+0.2082，R2=0.9996，线性范围为0.625～10 g/L（图5）。分别将质量浓度为0.625，1.25，2.5，5，10 g/L的乳铁蛋白标准品溶液依次进样5次，所得的5个浓度迁移时间RSD分别为0.8%，1.1%，0.6%，1.2%和1.5%；峰面积RSD分别为1.2%，1.4%，0.9%，0.8%，1.1%。最低检出限（S/N=3）为0.03125 g/L。

2.5 原料纯度测定结果

将4种已配置好的质量浓度均为5.0 g/L乳铁蛋白溶液，连续重复进样5次，计算得峰面积分别为哥兰比亚2172226，统园2236522，TATURA2255310，Westland1791031；峰面积RSD分别为1.0%，0.8%，1.2%，0.9%；电泳图分别为图6～图9所示。

图4 不同质量浓度下乳铁蛋白电泳结果

图5 乳铁蛋白标准曲线线性相关

图6 乳铁蛋白A电泳结果

图7 乳铁蛋白B电泳结果

3 原料纯度的测定

图8 乳铁蛋白C电泳结果

图9 乳铁蛋白D电泳结果

表1为4种乳铁蛋白原料纯度测定结果。由表1可以看出，毛细管电泳法测定的纯度值略低于厂家给定的纯度值（HPLC测定）。主要原因是毛细管法分离效率高，HPLC在分离过程中未能将一些杂质峰彻底分离，而毛细管电泳图中能够清晰看到（如图6～图9中的小峰）。此外，由图9可以看出，主峰前面小峰分离较彻底，说明部分乳铁蛋白中铁饱和度发生变化，对乳铁蛋白分子结构产生影响，导致分离较彻底。由此也可以说明本方法在测定蛋白质时，具有高分辨率、灵敏度高等优点，是一种有效的蛋白检测手段。

表1 4种乳铁蛋白原料纯度测定结果

4 结 论

本研究通过动态涂层法对非涂层毛细管进行了处理，通过对波长、缓冲液及pH值、添加剂等条件的优化，在此基础上采用外标法对4种乳铁蛋白原料的纯度进行了检测。检测结果显示，运用此方法实现了乳铁蛋白原料的快速检测，同时解决了蛋白在非涂层管内壁吸附的问题，提高了检测灵敏度，与其他方法相比具有分析时间短、分离效率高、节省成本等优点，适用于乳铁蛋白原料的入厂检测。

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Rapid detection of lactoferrin purity of raw materials by High-Performance Capillary Electrophoresis

LIU Yu，CHEN Wei，SHI Yu-dong，LI Zhi-wei，GAO Zeng-li，HOU Hui-m in，CHEN Yun
(Inner Mongolia Meng Niu Dairy Industry(Group)Co.,Ltd，R&D innovation system，Huhhot，Inner Mongolia 011500，China)

Established a rapid detect method for lactoferrin by Dynamic Coating Capillary Electrophoresis.And use this method detected different raw material purity of lactoferrin.The detection of four kinds of Lactoferrin raw material purity respectively for Glanbia：91.05%，TOONG YEUAN：93.62%，TATURA:94.38%，Westland:75.81%;relative standard deviation(RSD)respectively for 1.0%，0.8%，1.2%and 0.9%.And compared the purity of raw materials provided with the suppliers，discussed the reason of the differences between the two.Results show that the dynamic coating method can effectively restrain the capillary wall adsorption of lactoferrin，is very effective for the detection of Lactoferrin and purity verification，provide a measure for the detection of these proteins.

High-Performance Capillary Electrophoresis；dynamic coating；lactoferrin；purity

TS252.7

：A

：1001-2230（2016）02-0043-04

2015-09-11

刘宇（1985-），男，研发工程师，主要从事乳制品研究与开发。

陈云