P-5m八肽对肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9表达的抑制作用

张濛川，韩　笑，安丽萍，徐广宇，李宏宇，杜培革

(北华大学药学院，吉林 吉林　132013)



P-5m八肽对肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9表达的抑制作用

张濛川，韩笑，安丽萍，徐广宇，李宏宇，杜培革

(北华大学药学院，吉林 吉林132013)

摘要：目的 探讨P-5m八肽对肝癌HepG2细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响，以及P-5m八肽的抗肿瘤作用机制.方法用终浓度为10 μmol/L和100 μmol/L的P-5m八肽分别对处于对数生长期的HepG2细胞进行处理，药物作用时间为36 h，36 h后将细胞裂解.采用Real-time PCR方法检测给药后细胞中MMP-2 和MMP-9 mRNA表达水平的变化；Western blot方法测定MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的变化.结果Real-time PCR检测显示终浓度为10 μmol/L和100 μmol/L的P-5m八肽对HepG2细胞刺激后，MMP-2和MMP-9的mRNA表达均受到抑制，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；Western blot检测结果表明：用10 μmol/L和100 μmol/L的P-5m八肽对HepG2细胞刺激后，MMP-2和MMP-9的蛋白表达均受到抑制，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05).结论 P-5m八肽可明显抑制HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的表达.

关键词：P-5m八肽；肝癌HepG2细胞；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9

【引用格式】张濛川，韩笑，安丽萍，等.P-5m八肽对肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9表达的抑制作用[J].北华大学学报(自然科学版)，2016，17(2)：191-195.

近年来，肝癌的发病率和死亡率在全球呈上升趋势，而引起肝癌死亡的主要原因是肝癌细胞的浸润和转移[1-2].研究[3-5]证明：基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是细胞外基质降解的重要因子，与肿瘤生长、浸润、转移过程密切相关.目前，临床上治疗肝癌的药物主要有维甲酸类、顺铂、环磷酰胺等[6].这些抗肿瘤药物大多数选择性低、毒副作用大，容易对机体造成重大伤害.随着研究的深入，小分子多肽在肿瘤治疗方面发挥越来越重要的作用，成为肿瘤研究的新热点[7-8].

本课题组近年来对P-5m八肽抗肿瘤转移的作用和机制进行了研究，目前已发现P-5m八肽对人源HCCLM3肝癌细胞的侵袭和转移具有抑制作用，并明确了其抑制作用可能与降低MMP-2的表达水平有关[9].但是P-5m八肽的抗癌作用机制是否与MMP-9的表达水平有关，目前还尚未报道.因此，本研究利用Real-time PCR方法检测肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的mRNA表达；利用Western blot方法检测MMP-2和MMP-9的蛋白表达变化，进一步探讨P-5m八肽的抗肿瘤转移机制，为后期临床药物的开发利用奠定理论基础.

1材料与方法

1.1材料

人肝癌HepG2细胞由北华大学药物分析教研室冻存；P-5m八肽(GHGKHKNK)由北华大学药学院姜爽老师通过Fmoc-固相多肽合成方法合成，经反相HPLC检测，纯度>97%；RPMI 1640、细胞培养液、胰蛋白酶(美国Gibico公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；TRIzol 试剂盒(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)；引物由上海生化公司合成；细胞裂解液、ECL检测试剂盒(碧云天公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；人MMP-2，MMP-9，β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司).

1.2方法

1.2.1细胞培养

肝癌HepG2细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，当细胞密度达到80%左右时传代.

1.2.2Real-time PCR检测MMP-2和MMP-9的mRNA表达

用0.25%胰蛋白酶消化处于对数生长期的HepG2细胞，将细胞悬液接种到10 cm细胞培养皿上，浓度为2×105个/mL；37 ℃、5%CO2培养24 h后，吸出培养基，并向培养皿中加入终浓度分别为0，10，100 μmol/L的P-5m八肽，继续培养36 h后，吸出培养基，并用PBS洗涤细胞，按照TRIzol 试剂说明书提取细胞总RNA.经紫外分光光度法和琼脂糖凝胶检测，RNA纯度和完整性合格，可进行下一步Real-time PCR反应；按照反转录试剂盒说明书用随机引物进行反转录反应；取上述反转录反应产物进行Real-time PCR扩增，引物序列如下：MMP-2(628 bp)sense 5′-GGCTGCCCTCCCCTTGTT TCCG-3′；antisense 5′-TTGGCCACATCTGGGTTGCC G-3′；MMP-9(569 bp)：sense 5′-GCCACGCGCTG GGCTTAGAT-3′；antisense 5′-CGCGCCTGTGTACA CCCACA-3′.反应体系：cDNA 0.5 μL，MMP-2(或MMP-9)的上游引物和下游引物1 μL，10 mmol dNTP Mix 0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，ddH2O补至总体积为25 μL.混合均匀按下列条件进行热循环：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环后72 ℃下充分延伸10 min.

1.2.3Western blot检测MMP-2和MMP-9的蛋白表达

将处于对数生长期的HepG2细胞接种到10 cm细胞培养皿上，浓度为2×105个/mL；37 ℃、5%CO2培养24 h后，吸出培养基，并向培养皿中加入终浓度分别为0，10，100 μmol/L的P-5m八肽，继续培养36 h.培养结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞两次；分别加入预冷的细胞裂解液1 mL在冰上裂解，30 min后用细胞刮刀将细胞迅速刮下，转移到1.5 mL Eppendorf管中；4 ℃下12 000 r/min离心15 min；将离心后的上清液吸出至干净Eppendorf管中，-80 ℃保存备用.采用BCA法检测样品中蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离样品.转膜并用脱脂奶粉进行封闭；加入相应适当浓度的一抗溶液，4 ℃下孵育过夜；TBST洗涤3次，以相同方法加入相应的二抗溶液，室温下孵育2 h；ECL发光显色，拍照.使用ImageJ软件对目标条带的光密度值进行分析.

1.2.4统计学分析

本实验结果采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析，P<0.05时差异具有统计学意义.

2结果

2.1P-5m八肽对HepG2细胞中MMP-2和MMP-9m RNA表达的影响

Real-time PCR检测结果表明：10 μmol/L P-5m八肽处理组MMP-2和MMP-9的mRNA表达量与对照组相比有明显减少(P<0.05)，分别减少23.3%和60.1%(如图1所示)；100 μmol/L P-5m八肽处理组MMP-2和MMP-9的mRNA表达量与对照组相比有明显减少(P<0.05)，分别减少49.2%和77.6%(如图1所示).因此，P-5m八肽能够明显抑制肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的mRNA表达.

2.2P-5m八肽对HepG2细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响

Western blot检测结果表明：10 μmol/L P-5m八肽处理组MMP-2和MMP-9的蛋白表达量与对照组相比有明显减少(P<0.05)，分别减少36.6%和57.3%(如图2-a，2-b所示)；100 μmol/L P-5m八肽处理组MMP-2和MMP-9的蛋白表达量与对照组相比有明显减少(P<0.05)，分别减少48.8%和68.7%(如图2-a，2-b所示).因此，P-5m八肽能够明显抑MMP-9的蛋白表达.

3讨论

肿瘤细胞的浸润和转移是恶性肿瘤的特征之一，也是导致癌症死亡的重要原因[10].研究[11-14]表明：肿瘤细胞的浸润和转移与细胞外基质的降解密切相关，肿瘤细胞主要通过分泌基质金属蛋白酶(MMPs)来降解细胞外基质.在MMPs家族中，MMP-2和MMP-9是Ⅳ型胶原降解的关键酶[15-17]，它们能够降解细胞外基质的各种成分并分泌生长因子，使基底膜缺损，肿瘤细胞极易通过缺损发生转移，给癌症的治疗带来重大困扰.肿瘤组织中的MMP-2和MMP-9活性往往比正常组织中高，说明肿瘤细胞已经发生转移，预后不良.因此，抑制MMP-2和MMP-9的活性可在一定程度上抑制肿瘤细胞的浸润和转移，成为抗肿瘤药物研究的新切入点.

近年来，具有抗肿瘤生物活性的人工合成小分子多肽受到广泛关注.一些小分子抗肿瘤多肽易于合成，纯度高，无免疫原性，选择性高，毒副作用较小，给药途径多，易于吸收[18-20].特别是一些靶向系统给药的修饰多肽，能够在肿瘤组织富集，将药物直接运送到肿瘤部位，大大降低了药物的毒副作用[21-22].这些优点为小分子抗肿瘤多肽药物的研发提供广阔前景.本课题组所研究的P-5m八肽是来源于人高分子量激肽原的第五结构区域,该结构区域与肿瘤细胞的转移、浸润、黏附、凋亡等密切相关.Kawasaki[23]针对该结构区域的特点设计合成P-5m八肽，已有实验证明：P-5m八肽能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10[24]和人肝癌HCCLM3细胞的转移[9].其中，P-5m八肽抑制肝癌HCCLM3细胞的转移是通过降低MMP-2的表达水平来发挥作用的，但是P-5m八肽的部分抗肿瘤转移机制仍然不清楚，其是否通过降低MMP-9活性抑制肿瘤细胞的转移也尚未知晓.

本研究以人肝癌HepG2细胞模型为基础，用终浓度为10 μmol/L和100 μmol/L的P-5m八肽分别对处于对数生长期的人肝癌HepG2细胞进行处理，药物作用时间为36 h，并以0 μmol/L组作为空白对照组.Real-time PCR检测结果表明：10 μmol/L P-5m八肽处理组MMP-2和MMP-9的mRNA表达量与对照组相比有明显减少(P<0.05)，分别减少23.3%和60.1%；100 μmol/L P-5m八肽处理组MMP-2和MMP-9的mRNA表达量与对照组相比有明显减少(P<0.05)，分别减少49.2%和77.6%.通过该实验发现，P-5m八肽能够明显抑制肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的mRNA表达.Western blot检测结果表明：10 μmol/L P-5m八肽处理组MMP-2和MMP-9的蛋白表达量与对照组相比有明显减少(P<0.05)，分别减少36.6%和57.3%；100 μmol/L P-5m八肽处理组MMP-2和MMP-9的蛋白表达量与对照组相比有明显减少(P<0.05)，分别减少48.8%和68.7%.通过该实验发现，P-5m八肽能够使肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平下降.MMP-2和MMP-9的过度表达使肿瘤细胞易于发生浸润和转移，在本研究中，P-5m八肽能够有效抑制肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的表达，从而抑制肝癌细胞外基质的降解，减少基底膜的缺损，抑制肝癌细胞的浸润和转移.

本研究表明：P-5m八肽对人肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的表达有抑制作用，其可能通过抑制人肝癌HepG2细胞中MMP-2和MMP-9的表达而减少细胞外基质的降解来抑制肝癌细胞的转移.

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【责任编辑：陈丽华】

Inhibitory Effects of P-5m Octapeptide on the Expressions of MMP-2 and MMP-9 in HepG2 Cells

Zhang Mengchuan，Han Xiao，An Liping，Xu Guangyu，Li Hongyu，Du Peige

(CollegeofPharmacy，BeihuaUniversity，Jilin132013，China)

Abstract：Objective To explore the impact of P-5m octapeptide on the expressions of matrix metalloproteinase -2(MMP-2)and matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in HepG2 cells，and to investigate the antitumor mechanism of P-5m octapeptide further.Methods The HepG2 cells in logarithmic growth phase were stimulated by P-5m octapeptide for 36 h at the concentrations of 10 μmol/L and 100 μmol/L，respectively.Then，the cells were treated after 36 h.The expressive variations of MMP-2 and MMP-9 mRNA were detected by Real-time PCR，and the changes of the expressions of MMP-2 and MMP-9 proteins were detected by western blot assay.Results Real-time PCR analysis showed that there were significant differences on the expressions of MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA compared with the control group(P<0.05)，after the cells were stimulated by P-5m octapeptide at the concentrations of 10 μmol/L and 100 μmol/L for 36 h，respectively.Western blot analysis showed that P-5m octapeptide could inhibit the expressions of MMP-2 protein and MMP-9 protein in HepG2 cells compared with the control group(P<0.05)after 36 h stimulation at the concentrations of 10 μmol/L and 100 μmol/L，respectively.Conclusion P-5m octapeptide can remarkably inhibit the expressions of MMP-2 and MMP-9 in HepG2 cells.

Key words：P-5m octapeptide；HepG2 cells；matrix metalloproteinase-2；matrix metalloproteinase-9

中图分类号：R73.3

文献标志码：A

作者简介：张濛川(1989-)，女，硕士研究生，主要从事抗肿瘤小分子多肽的研究，E-mail：mengchuan812@126.com；通信作者：韩笑(1981-)，女，博士，讲师，硕士生导师，主要从事抗肿瘤小分子多肽研究，E-mail：hanxiaorumeng@126.com；杜培革(1963-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事生物大分子和功能食品开发研究，E-mail：dupeige@126.com.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31201061)；吉林省发改委资助项目(2013G019)；吉林省科技发展计划项目(20100944；20110729)；吉林省教育厅科学技术研究项目(2015144)；吉林市科技局杰出青年专项(2013625030).

收稿日期：2015-07-12

文章编号：1009-4822(2016)02-0191-05

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.010