P2X7受体对缺氧诱发小鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

郝旭红，裴　涌，孙晓楠



·实验论著·

P2X7受体对缺氧诱发小鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

郝旭红，裴涌，孙晓楠

Effect of P2X7purinoceptor on hypoxia-induced apoptosis of retinal ganglion cells

Xu-Hong Hao，Yong Pei，Xiao-Nan Sun

Foundation item:Natural Science Foundation of Liaoning(No.2014020184)

Department of Ophthalmology,Shenyang the Fourth Hospital of People, Shenyang 110031, Liaoning Province, China

Correspondence to:Xu-Hong Hao. Department of Ophthalmology, Shenyang the Fourth Hospital of People, Shenyang 110031, Liaoning Province, China.sysyhxh@163.com

Received：2015-11-16Accepted：2016-03-18

Abstract

•AIM: To investigate the effect of P2X7on hypoxia-induced apoptosis of retinal ganglion cells in mice.

•METHODS: According to the different factors, retinal ganglion cells of the mouse were randomly divided into four groups: control group (G1), hypoxia group (G2), hypoxia + agonist (BzATP) group (G3), hypoxia + antagonistic agent (BBG) group (G4). Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was used to detect the survival rate of cells; the rate of cell apoptosis was determined by Annxin V/PI staining flow cytometry; Western Blot analysis was employed to detect the protein expressrion levels of cleave-caspase-3 and cleave-PARP.

•RESULTS: Compared with control group, the results significantly indicated the survival rate of cells decreased and the rate of apoptosis increased treated with hypoxia. In addition, the protein levels of cleave-caspase-3 and cleave-PARP were remarkably higher than the control group. BzATP markedly augmented the apoptosis induced by hypoxia, and BBG pretreatment observably decreased the hypoxia-induced apoptosis.

•CONCLUSION: P2X7purinoceptor could be activated by hypoxia, and participate in the apoptosis of retinal ganglion cells.

KEYWORDS:•P2X7 purinoceptor；hypoxia；retinal ganglion cells；apoptosis

Citation:Hao XH, Pei Y, Sun XN.Effect of P2X7purinoceptor on hypoxia-induced apoptosis of retinal ganglion cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(4):622-624

摘要

关键词：嘌呤受体P2X7；缺氧；视网膜神经节细胞；细胞凋亡

引用：郝旭红，裴涌，孙晓楠.P2X7受体对缺氧诱发小鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响.国际眼科杂志2016;16(4):622-624

0引言

视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)是位于视网膜最终段的神经细胞，其轴索为视神经纤维。缺血、缺氧导致RGC的凋亡，甚至死亡，是许多视网膜和视神经疾病发展到最后的必经之路，如糖尿病视网膜病变、青光眼、视网膜中央动脉阻塞等，因此研究缺氧诱发的RGC凋亡机制有可能找到治疗和预防视网膜和视神经疾病新的治疗方法，从而避免更多人丧失宝贵的视力。近年来，嘌呤和嘌呤受体作为重要的信号分子备受关注。P2X7属于核苷酸P2X 受体家族，P2X7受体通道开放，可引起胞外信号的传导、引起相应的生物学效应，包括炎症反应、细胞凋亡和增殖等。研究表明，RGC层中有P2X7受体的表达。本实验通过建立视网膜神经节细胞RGC-5缺氧模型，观察并探讨嘌呤受体P2X7对缺氧诱发RGC凋亡的影响，希望为预防和治疗RGC缺血、缺氧诱发的细胞凋亡提供实验依据。

1材料和方法

1.1材料小鼠视网膜神经节细胞株RGC-5，购自ATCC。胎牛血清、DMEM 购自Invitrogen公司；BzATP、BBG、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG购自Sigma公司；cleave-caspase-3、cleave-PARP、β-actin一抗购自Santa Cruz公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海贝博生物公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及实验分组用DMEM培养基(含10%胎牛血清、青霉素、链霉素100U/mL)，在37℃、5% CO2孵育箱内培养小鼠视网膜神经节细胞株RGC-5，3～4d传代1次。将细胞随机分为4组，正常对照组(G1)、缺氧组(G2)、缺氧+激动剂(BzATP)组(G3)、缺氧+拮抗剂(BBG)组(G4)；其中缺氧模式为将培养基更换为经缺氧处理(预先用氮气饱和)无糖、无血清培养基，然后放入37℃、95% N2、5% CO2三气培养箱中6h，之后更换含糖、含血清培养基，置于37℃、5% CO2孵育箱内继续培养4h。G3组在缺氧处理的同时给予100μmol/L BzATP；G4组先给予100nmol/L BBG预处理30min后，再给予缺氧处理。

1.2.2 MTT法检测各组小鼠RGC细胞存活率将细胞以5×103/孔接种到96孔细胞培养板中，培养24h后，按上述各分组处理方法处理细胞后，终止培养，每孔加入MTT 20μL(浓度为5g/L)，继续避光培养4h，终止培养，小心弃上清，加入200μL DMSO溶解MTT，在酶联免疫检测仪上测定波长为490nm处各孔的吸光度。

1.2.3流式细胞仪检测各组小鼠RGC细胞凋亡情况收集各组细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，加入试剂盒中结合缓冲液(Binding Buffer)500μL悬浮细胞。加入5μL的Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀，于冰上避光条件孵育15min，然后加入10μL PI染色液后孵育15min，采用流式细胞仪计数1×104个细胞，结果使用双变量流式细胞仪的散点图表示，同时计算凋亡细胞率。

1.2.4 Western Blot检测各组小鼠RGC中cleave-PARP和cleave-caspase-3蛋白的表达细胞裂解液裂解细胞，收集细胞，超声处理，离心，上清液置于-80℃保存备用。应用BCA方法测定蛋白浓度。凝胶电泳，转膜并采用特异性抗体进行Western Blot分析，cleave-PARP和cleave-caspase-3(1∶1000)，β-actin(1∶1000)。二抗：碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG(1∶1000)。采用凝胶成像分析系统分析和计算蛋白的灰度值，以目的条带与内参β-actin的平均灰度值的比值表示蛋白水平，进行半定量分析。

统计学分析：应用Graphpad Prism 5统计软件进行统计学分析。所有数据用平均值±标准误表示。组间比较采用单因素方差分析。以P< 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠RGC细胞存活率应用MTT 法检测RGC-5细胞存活率，各组细胞存活百分率分别为：G1组(100.00±2.13)%、G2组(57.14±3.07)%、G3组(42.16±2.61)%、G4组(74.56±2.98)%。与G1组相比，G2、G3和G4组的 RGC-5细胞存活率显著降低(P<0.05)；经100μmol/L BzATP与缺氧共同处理RGC-5细胞后，与G2组相比，细胞存活率明显降低(P<0.05)；而100nmol/L BBG预处理细胞后，与G2组相比，细胞RGC-5存活率显著提高(P<0.05，图1)。

2.2各组小鼠RGC细胞凋亡情况应用流式细胞仪检测RGC-5细胞凋亡率，各组细胞凋亡率分别为：G1组(12.25±2.50)%、G2组(48.00±4.55)%、G3组(59.05±2.10)%、G4组(37.5±5.20)%。与正常对照组相比，G2、G3和G4组的 RGC-5细胞均出现明显的细胞凋亡(P<0.05)；其中缺氧+激动剂组的细胞凋亡率最高，与缺氧组相比，有统计学差异(P<0.05)；缺氧+拮抗剂组的细胞凋亡率，与单纯缺氧组相比，明显下降(P<0.05)，但仍高于正常对照组(图2～3)。

图1各组小鼠视网膜神经节细胞RGC-5存活率情况aP<0.05vsG1组；cP<0.05vsG2 组；G1：正常对照组；G2：缺氧组；G3：缺氧+激动剂(BzATP)组；G4：缺氧+拮抗剂(BBG)组。

图2各组小鼠视网膜神经节细胞RGC-5凋亡情况G1：正常对照组；G2：缺氧组；G3：缺氧+激动剂(BzATP)组；G4：缺氧+拮抗剂(BBG)组。

图3各组小鼠视网膜神经节细胞RGC-5凋亡率aP<0.05vsG1组；cP<0.05vsG2组；G1：正常对照组；G2：缺氧组；G3：缺氧+激动剂(BzATP)组；G4：缺氧+拮抗剂(BBG)组。

2.3各组小鼠RGC中cleave-PARP和cleave-caspase-3蛋白的表达Western Blot检测视网膜神经节RGC-5细胞内cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表达，各组cleaved-PARP/β-actin相对灰度值分别为：G1组0.20±0.03，G2组0.62±0.03，G3组0.78±0.02，G4组0.46±0.05；各组cleaved-caspase-3/β-actin相对灰度值分别为：G1组0.21±0.03，G2组0.49±0.04，G3组0.66±0.04，G4组0.36±0.06。与G1组相比，G2、G3和G4组的cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表达均显著升高(P<0.05)；其中G3组cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表达最多，而G4组在P2X7拮抗剂的作用下，使cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表达明显低于G2组(P<0.05)，但仍高于G1组(图4～6)。

图4各组小鼠视网膜神经节细胞RGC-5中cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表达G1：正常对照组；G2：缺氧组；G3：缺氧+激动剂(BzATP)组；G4：缺氧+拮抗剂(BBG)组。

图5各组小鼠视网膜神经节细胞RGC-5中cleaved-PARP蛋白表达aP<0.05vsG1组；cP<0.05vsG2组。

图6各组小鼠视网膜神经节细胞RGC-5中cleaved-caspase-3蛋白表达aP<0.05vsG1组；cP<0.05vsG2组。

3讨论

嘌呤受体(purinoceptor，P受体)分为P1和P2两类。其中P2受体主要由核苷酸激活， 包括P2X 和P2Y两大家族。P2X 家族属配体门控离子通道，包括7种亚型，即P2X1-7。其中P2X7受体与其它P2X受体亚型显著不同，在低浓度激动剂刺激下可以引起非选择性单价和多价阳离子通道开放，允许K+、Na+、Ca2+等阳离子跨膜流动，而Ca2+大量内流可引发细胞的凋亡；在重复或者长时间P2X7激活时，P2X7受体通道逐渐扩大，可增至3nm孔洞，对各种阳离子包括分子质量达900Da 的有机阳离子通透，从而导致细胞凋亡[1]，因此P2X7是一种重要的凋亡受体。P2X7受体在体内的分布极为广泛，视网膜内、外层神经元有多种类型P2X受体表达，其中P2X7受体主要分布在RGCs层[2-3]。近年来研究发现P2X7受体与视网膜的功能密切相关，例如在玻璃体视网膜病变中，P2X7受体的表达增加；受体的激活可引起视网膜周细胞收缩等[4-5]。ATP是P2X7受体的天然激动剂，但与P2X7受体亲和力比较低。2’-3’-O-(4-benzoylbenzoyl)-ATP(BzATP)是P2X7受体最强的激动剂，与P2X7受体的亲和力是ATP的10～100倍[6]；P2X7受体拮抗剂包括Brilliant Blue G (BBG)、oxidized ATP (oxATP)、A-438079等，其中BBG在nmol/L浓度水平即选择性拮抗P2X7受体[7-8]。RGC是视网膜最终端的神经元，在视觉信息的整合和传递中至关重要。缺血、缺氧会导致RGC损伤、变性和凋亡，最终引起视觉功能丧失[9-10]，是许多视网膜和视神经疾病发展到最后的必经之路，如糖尿病视网膜病变、青光眼、视网膜中央动脉阻塞等，因此研究缺氧诱发的RGC细胞凋亡机制有可能找到治疗预防视网膜和视神经疾病新的治疗方法，从而避免更多人丧失宝贵的视力。基于上述，我们观察了嘌呤受体P2X7对缺氧诱发RGC凋亡中的影响，首先，缺氧处理视网膜神经节细胞株RGC-5，MTT检测细胞存活率、流式细胞仪检测细胞的凋亡率及Western Blot检测细胞内cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表达，其中caspase-3为caspase家族重要成员，是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路，而PARP是caspase-3主要底物，两者在细胞凋亡中起到重要作用。实验结果显示，与正常对照组相比，缺氧可以使RGC-5细胞的存活率明显降低，凋亡率显著升高，cleaved-PARP和cleaved-caspase-3蛋白表达均显著升高(P<0.05)，这些结果表明，缺氧可以诱发视网膜神经节细胞RGC-5发生凋亡。为了进一步检测P2X7受体是否参与缺氧导致的RGC-5细胞凋亡，分别用受体的激动剂BzATP和拮抗剂BBG处理细胞，实验结果表明，P2X7受体激动剂BzATP能明显加重缺氧诱发的细胞凋亡，而BBG预处理可以显著拮抗缺氧所致的细胞凋亡。这些实验结果证明缺氧能激活RGC嘌呤受体P2X7，并参与RGC的凋亡。但P2X7受体通过何种机制参与RGC的凋亡尚需进行下一步实验深入探讨。

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DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.4.08

收稿日期：2015-11-16 修回日期： 2016-03-18

通讯作者：郝旭红.sysyhxh@163.com

作者简介：郝旭红，主任医师，硕士研究生导师，病房副主任，研究方向：眼底病、青光眼、神经眼科。

基金项目：辽宁省自然科学基金(No.2014020184)
作者单位：(110031)中国辽宁省沈阳市第四人民医院眼科

目的：探讨嘌呤受体P2X7对缺氧诱发小鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响。

方法：以小鼠视网膜神经节细胞株RGC-5为研究对象，按照不同处理因素将细胞随机分为4组：正常对照组(G1)、缺氧组(G2)、缺氧+激动剂(BzATP)组(G3)、缺氧+拮抗剂(BBG)组(G4)；采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的存活率；用Annxin V/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率；Western Blot检测细胞内cleave-caspase-3和cleave-PARP蛋白的表达。

结果：与正常对照组相比，RGC-5细胞经缺氧处理后，细胞存活率明显降低；凋亡率显著升高；细胞内cleave-caspase-3和cleave-PARP蛋白表达增加；P2X7受体激动剂BzATP能明显加重缺氧诱发的细胞凋亡，而BBG预处理可以显著拮抗缺氧所致的细胞凋亡。

结论：缺氧能激活视网膜神经节细胞嘌呤受体P2X7，并参与视网膜神经节细胞的凋亡。