海参肠道酵母菌产胞外多糖的抗氧化性

崔 　 静，　李 　 成，　孙 晓 萌，　刘 佳 欣，　张 　 涵，　丛 丽 娜

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )



海参肠道酵母菌产胞外多糖的抗氧化性

崔 静，李 成，孙 晓 萌，刘 佳 欣，张 涵，丛 丽 娜

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:研究了3株源于海参肠道的酵母菌HS-J6，HS-J8和HS-J9中胞外多糖的提取及其抗氧化活性。采用95%乙醇沉淀、Sevage法除蛋白、透析、冷冻干燥获得其胞外粗多糖，分别命名为EPS6、EPS8和EPS9，采用3种方法测定它们产胞外多糖的抗氧化能力。结果表明，3种胞外多糖都具有一定的抗氧化能力，EPS6和EPS8的还原力相近，明显高于EPS9。EPS9对的清除能力最强，清除率最大为35.3%；EPS6对·OH 的清除能力最强，最高可达91.5%。

关键词:酵母菌；胞外多糖；抗氧化

0引言

微生物多糖是细菌、真菌、蓝藻等微生物在代谢过程中产生的对微生物有保护作用的生物高聚物，具有还原氧化剂的能力，又因其安全无毒、理化性质独特等优良性质而倍受关注[1]。研究发现，海洋共附生微生物可能参与大型宿主生物的生物合成、代谢及其他生命活动[2]。海洋共附生微生物胞外多糖的特殊结构和功能已引起广泛关注，是开发多糖类海洋新药的重要资源[3-4]。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

3株酵母菌HS-J6，HS-J8和HS-J9，本实验室分离保藏。

1.1.2培养基

种子培养基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，pH自然。

发酵培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，硫酸铵1.5%，磷酸二氢钾0.25%，pH 6.6～6.7。

1.2方法

1.2.1胞外多糖的提取

1.2.1.1酵母菌的发酵培养

将-80 ℃保藏的菌株，按4%体积分数的接种量接入种子培养基，28 ℃、160 r/min摇床振荡培养13～16 h，然后将活化后的菌株种子液，按4%的体积分数接入发酵培养基，在28 ℃、160 r/min的条件下摇床振荡培养48 h。

1.2.1.2酵母胞外多糖的提取

实验采用醇沉提取法，具体流程如下：发酵液离心收集上清液，加3倍体积95%乙醇(4 ℃，沉降处理12 h)离心收集沉淀。依次使用95%乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤得粗多糖样品，用ddH2O溶解，并用Sevage法去除蛋白5次[8]。上清液加3倍体积95%乙醇(4 ℃，沉降处理12 h)，离心后收集沉淀，利用ddH2O溶解沉淀样品后，透析(截留分子质量为3.5 ku)，冷冻干燥得酵母胞外粗多糖EPS6，EPS8和EPS9。

1.2.2多糖纯度测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[9]。将冷冻干燥后的多糖干粉用蒸馏水制成质量浓度为1.0 mg/mL 的多糖溶液，用时取0.5 mL多糖液补水至2 mL，按葡萄糖标准曲线的绘制方法进行操作，根据标准曲线回归方程计算样品中多糖的含量，确定胞外粗多糖的纯度。

利用紫外(UV)光谱法检测蛋白杂质。将胞外多糖以蒸馏水配成质量浓度为1.0 mg/mL的溶液，在190～600 nm利用紫外分光光度计进行紫外全波长扫描，以确定胞外多糖粗品中是否含有蛋白质缀合物[10]。

1.2.3多糖还原力测定

取2 mL不同质量浓度的样品溶液(0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)，加入2.5 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1%铁氰化钾溶液2.5 mL，得混合物于50 ℃水浴保温20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液。吸取混合溶液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，摇匀，室温下反应10 min，以蒸馏水为空白，在700 nm处测吸光度，吸光度代表多糖的还原能力。不同浓度的样品分别作3次独立平行实验，取平均值。

1.2.4多糖对 O2-·自由基的清除作用

取25 ℃预热20 min的Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L，pH 8.2)2.5 mL，加入25 ℃预热20 min 的45 mmol/L邻苯三酚10 μL，并加入不同质量浓度(0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的样品溶液，反应体系总体积为2.51 mL，摇匀，体系在25 ℃恒温水浴中精确反应4 min，每隔30 s 在325 nm处测定溶液的吸光度，并计算其吸光度变化率(ΔAs)。对照组：以Tris-HCl缓冲液替代样品溶液，计算吸光度变化率(ΔAc)[11]。

1.2.5多糖对·OH 自由基的清除作用

取磷酸盐缓冲液(150 mmol/L，pH 7.4)2.85 mL，0.26 mg/mL番红花红T 0.15 mL，1% H2O20.6 mL，0.56 mmol/L EDTA-Fe2+溶液0.525 mL，加入不同质量浓度 (0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL)的样品溶液，反应体系总体积为3 mL，摇匀，37 ℃恒温水浴反应30 min，520 nm处测定吸光度即样品组(As)。空白组(A0)：以等体积磷酸盐缓冲液代替H2O2、EDTA-Fe2+和样品溶液。对照组(Ac)：以等体积的磷酸盐缓冲液代替多糖溶液[12]。

·OH 清除率=[(As-Ac)/(A0-Ac)]×100%。

2结果与分析

2.1多糖的纯度测定

苯酚-硫酸法得葡萄糖标准曲线：y=12.253 33x+0.005 7(R2=0.995 68)。

根据葡萄糖标准曲线计算出1.0 mg/mL样品溶液中多糖的质量浓度分别为：EPS6，0.676 mg/mL；EPS8，0.628 mg/mL；EPS9，0.712 mg/mL。因此，粗多糖的纯度分别为：EPS6，67.6%；EPS8，62.8%；EPS9，71.2%。

对3株酵母菌胞外多糖粗品进行紫外全波长扫描(190～600 nm)，检测生物大分子杂质(蛋白)紫外吸收情况，结果如图1所示。从图1(a)中可以看出，3株酵母胞外多糖在280 nm处均有吸收，说明粗多糖样品中含有一定的蛋白杂质。图1(b)显示A280小于0.1，这表明多糖样品中的蛋白含量很低。

图13种胞外多糖的紫外全波长(a)和240～300 nm波段的扫描图(b)

Fig.1Ultravioletfullwavelengthscans(a)and240-300nmscans(b)ofthreeextracellularpolysaccharides

采用苯酚-硫酸法检测多糖的纯度。浓硫酸先将多糖水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。该化合物在490nm处，糖浓度和光吸收呈线性关系。因此，苯酚/浓硫酸不能与蛋白出现类似的衍生物，故实验排除了样品中杂质蛋白的干扰。

从胞外粗多糖的纯度结果分析，样品中除了少量蛋白之外，一定含有其他其杂质分子。但是，本实验获得的粗多糖样品的纯度基本可以满足后续抗氧化结果的要求[13-14]。

2.2多糖还原力测定

还原力是抗氧化活力的重要指标，一般情况下，还原力与抗氧化活性之间有显著的相关性[15]，因此实验首先测了3种多糖的还原力。实验结果表明，3株酵母菌的胞外多糖均表现出了一定的还原能力。样品的还原能力和多糖的质量浓度在一定的范围内具有较明显的线性关系，如图2所示，其还原能力随着浓度的升高而增强。当多糖质量浓度不高于1.0mg/mL时，EPS6和EPS8的还原力相近，明显高于EPS9；当多糖质量浓度大于1.0mg/mL时，EPS8的还原力略高于EPS6，明显高于EPS9。

图2　3种多糖的还原能力

图3　3种多糖对自由基的清除作用

3 O-2·

Fig.radicalscavengingactivityofthree

polysaccharide

2.4多糖对·OH自由基的清除作用

检测了3种胞外多糖EPS6，EPS8和EPS9对·OH自由基的清除能力，结果如图4所示。从图4可以看出，3株酵母菌胞外多糖对·OH自由基都具有较强的清除能力，并随着浓度的增加其清除率逐渐上升。当多糖质量浓度不高于0.5mg/mL时，EPS6和EPS8对·OH自由基的清除能力相近，都略高于EPS9；至稳定时，其对·OH自由基的清除率均大于60%；其中，当多糖质量浓度升高至2.0mg/mL时，EPS6对·OH具有明显的清除作用，清除率高达91.5%。

图4　3种多糖对·OH 自由基的清除作用

3结论

3株筛自海参肠道的酵母菌发酵产生的胞外多糖具有一定的抗氧化活性，同时又具有生产周期短、成本低廉且无原料来源问题等优点。综上所述，海参肠道酵母菌发酵得到的胞外多糖作为天然抗氧化剂具有广阔的应用和开发前景。

参考文献:

[1] 魏培莲.微生物胞外多糖研究进展[J].浙江科技学院学报,2002,14(2):8-12.

[2] 张姗姗,王长云,魏晓蕾,等.海洋微生物胞外多糖结构与生物活性研究进展[J].微生物学通报,2007,34(1):153-156.

[3] 苏文金,黄益丽,黄耀坚,等.产免疫调节活性多糖海洋放线菌的筛选[J].海洋学报,2001,23(6):114-119.

[4]LIJ,CHENKS,LINXZ,etal.ProductionandcharacterizationofanextracellularpolysaccharideofantarcticmarinebacteriaPseudoa lteromonassp.S-15-13[J].ActaOceanologicaSinica, 2006, 25(6): 106-115.

[5]MANIVSSAGANP,SIVASANKARP,VENKATESANJ,etal.ProductionandcharacterizationofanextracellularpolysaccharidefromStreptomyces violaceusMM72[J].InternationalJournalofBiologicalMacromolecules, 2013, 59: 29-38.

[6] 孟繁磊,陈瑞战,张敏,等.刺五加多糖的提取工艺及抗氧化活性研究[J].食品科学,2010,31(10):168-174.

[7]WUQ,ZHENGC,NINGZX,etal.Studyonextractionandantioxidanteffectsofcrudealkali-solubletremellapolysaccharide[J].FoodScience, 2007, 28(6): 153-155.

[8] 刘天华,乔梦,李乐乐,等.海洋细菌0417产胞外多糖发酵条件的优化[J].中国酿造,2011(6):107-110.

[9] 包怡红,刘奇,王薇.不同发酵条件对酿酒酵母产胞内胞壁多糖的影响[J].酿酒,2012,39(1):51-55.

[10] 霍光华,李来生,高荫榆.波谱在多糖结构分析上的应用[J].生命的化学,2002,22(2):194-196.

[11] CHENG Y K, LI L, MENG Z K, HOU A L, et al. Component analysis and free radicals scavenging activity of physalis alkekengiL.polysaccharide[J]. Chemical Research in Chinese Universities, 2008, 24(2): 167-170.

[12] 刘凤,叶淑红,王际辉,等.海洋假单胞菌pf-6胞外多糖吸湿保湿和抗氧化活性研究[J].食品工业科技,2011,32(11):68-71.

[13] 孙红梅,张星星,白玉,等.海洋假单胞菌胞外多糖的抗氧化性[J].大连工业大学学报,2001,25(2):197-204.

[14] 刘莎,叶淑红,王际辉,等.一株细菌ps-5胞外多糖抗氧化性能研究[J].食品科技,2010,35(6):111-114.

[15] 王丽华,段玉峰,马艳丽,等.槐花多糖的提取工艺及抗氧化活性研究[J].西北农林科技大学学报,2008,36(8):213-217.

The antioxidant effects of extracellular polysaccharide of yeasts from sea cucumber intestine

CUIJing,LICheng,SUNXiaomeng,LIUJiaxin,ZHANGHan,CONGLina

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:Three yeast strains of exopolysaccharide-producing named HS-J6, HS-J8 and HS-J9 were isolated from sea cucumber intestine. Three water-soluble polysaccharides named EPS6, EPS8 and EPS9, were extracted by 95% ethanol precipitation, deproteinization via Sevage, dialysis and lyophilization. The antioxidation of extracellular polysaccharide was test, and the results showed that the reduction capacity of EPS6 and EPS8 were significant higher than that of EPS9. But EPS9 exhibited high scavenging effects on radicals, with the maximum scavenging rate about 35.3%. The ·OH radical scavenging activity of EPS6 was the highest, with the scavenging rate about 91.5%.

Key words:yeast; extracellular polysaccharide; antioxidant effects

中图分类号:TS201.3；Q539

文献标志码:A

作者简介:崔 静(1989-)，女，硕士研究生；通信作者：丛丽娜(1962-)，女，教授，E-mail:congln@dlpu.edu.cn.

基金项目:海洋公益性行业科研专项项目(201405003-3)；辽宁省高等学校重大科技平台专项项目(LT2011008);辽宁省教育厅一般项目(L2014217).

收稿日期:2015-03-05.

文章编号:1674-1404(2016)02-0084-04