血清磷酸化高分子量神经微丝蛋白与大鼠脊髓损伤程度的相关性①

何件根，李建军，杨明亮，武　亮，杨德刚



血清磷酸化高分子量神经微丝蛋白与大鼠脊髓损伤程度的相关性①

何件根1，李建军2,3，杨明亮2,3，武亮2,3，杨德刚2,3

[摘要]目的研究血清磷酸化高分子量神经微丝蛋白(pNF-H)在脊髓损伤动物模型中的动态变化规律及其与脊髓损伤程度的相关性。方法20只Sprague-Dawley大鼠等分为空白对照(A)组及脊髓损伤轻(B)、中(C)、重(D)度组，检测大鼠血清pNF-H水平、BBB评分及残存白质面积百分比。结果B、C、D组大鼠血清pNF-H在术后12 h及3 d出现两个高峰；3组间有显著性差异(P<0.05)；损伤后3 d血清pNF-H水平与14 d时BBB评分、残存白质面积百分比呈负相关性(r=-0.987,r=-0.978)。结论脊髓损伤后大鼠血清pNF-H水平存在双峰现象；脊髓损伤程度越重，大鼠pNF-H水平越高；pNF-H水平可以预测脊髓损伤严重程度。

[关键词]脊髓损伤；神经微丝蛋白；分子生物学评估；大鼠

[本文著录格式]何件根，李建军，杨明亮，等.血清磷酸化高分子量神经微丝蛋白与大鼠脊髓损伤程度的相关性[J].中国康复理论与实践,2016,22(3):274-277.

CITED AS:He JG,Li JJ,Yang ML,et al.Correlation between serum phosphorylated high-molecular-weight neurofilament and severity of spinal cord injury in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(3):274-277.

作者单位：1.北京小汤山医院，北京市102211；2.首都医科大学康复医学院，北京市100068；3.中国康复研究中心北京博爱医院，北京市100068。作者简介：何件根(1985-)，男，汉族，江西吉安市人，硕士研究生，主要研究方向：脊髓损伤康复。通讯作者：李建军(1962-)，男，汉族，山东威海市人，教授，博士生导师，主要研究方向：脊柱脊髓损伤临床治疗与康复、康复管理。E-mail:crrc100@163.com。

脊髓损伤导致的感觉功能及运动功能缺失，不仅由原发性损伤引起，各种原因引起的继发性损伤也会导致脊髓神经功能进一步缺失，包括炎症反应、缺氧及毒素等导致的迟发型神经元及胶质细胞凋亡、轴突退化等[1-2]。人们一致认为应该在脊髓损伤早期进行治疗干预[3-4]。但脊髓损伤早期的治疗效果很难评价。脊髓损伤的基础严重程度很难评估，主要是因为脊髓休克期的存在[5-6]以及其他因素。分子标记物作为微观水平的标记物，因样本采集方便、可实时追踪等优势，在脊髓损伤的研究中逐渐受到重视，其中磷酸化高分子量神经微丝蛋白(phosphorylated high-molecular-weight neurofilament,pNF-H)因其特异性及稳定性相对较好，近年出现将其应用于脊髓损伤方面的研究。Shaw等在大鼠T11打击模型及脊髓横断模型上发现，大鼠血清pNF-H存在双峰现象[7]；Ueno等行大鼠脊髓损伤后四环素注射实验，结果显示四环素组pNF-H水平较对照组低[8]。Hayakawa等将pNF-H水平与神经功能ASIA分级进行比较，指出血清pNF-H与脊髓损伤严重程度存在一定程度相似[9]。本研究探讨脊髓损伤大鼠血清pNF-H与脊髓损伤严重程度的关系。

1料材与方法

1.1实验动物及分组

清洁级成年雌性Sprague-Dawley大鼠20只，军事科学院实验动物中心提供，体质量(220±10)g。分为A、B、C、D 4组，每组5只。

1.2模型制作

大鼠常规饲养1周，观察无异常进行造模。固定大鼠，10％水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，以T10棘突为中心，切口大小(2.25±0.25)cm，逐层暴露棘突；行T10椎板全切，暴露硬脊膜。A组直接缝合切口。B、C、D组分别用NYU打击器打击脊髓，打击杆质量10 g，打击杆高度依次为12.5 cm、25 cm、50 cm[10-11]。止血，缝合切口，消毒并铺干净纱布。将大鼠置于(23±2)℃室温单笼饲养，不限制饮水饮食，人工辅助排尿、排便，每天3次，直至大鼠能够自行排尿便。

1.3 pNF-H检测

分别于术后15 min、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d尾静脉采血，LG15-W高速微量离心机室温下12000 r/min离心5 min，上清液滴入0.5 ml清洁离心管，-80℃保存。酶联接免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)测定pNFH水平。

1.4行为学评分

分别于术后2 d、7 d、14 d行BBB评分。在安静、自然状态下进行，持续观察大鼠运动情况5 min。评定者对大鼠分组情况不知情。

1.5组织病理学观察

术后14 d固定大鼠，10％水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，打开胸腔，切口(2.00±0.25)cm，通过心尖依次行生理盐水及福尔马林全身灌注，待大鼠僵硬后行T10后路开窗，方法同造模。以损伤点为中心获取脊髓标本，长(2.50±0.25)cm。石蜡包埋，切片机厚4 μm连续切片。选取脊髓损伤中心3张切片行Luxol Fast Blue(LFB)染色；光镜下观察并摄片，采用Image Pro Plus(IPP)6.0软件进行图像处理，计算残存白质面积百分比：

1.6统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。各组间pNF-H浓度行重复测量方差分析，各组大鼠术后3 d血清pNF-H水平与术后14 d BBB评分、残存白质面积百分比行线性相关分析。显著性水平α=0.05。

2结果

2.1 pNF-H

A组pNF-H持续处于0水平，B、C、D组pNF-H均出现基本一致的双峰现象，第1次峰值出现于术后12 h左右，第2次峰值出现于术后3 d左右，随后持续降低。各组间血清pNF-H浓度有显著性差异(F= 93.590,P<0.05)。

图1　各组大鼠血清pNF-H动态变化曲线

2.2 BBB评分

组内比较，不同时间点评分存在显著性差异(P= 0.04)；组间比较，各组间术后2 d无显著性差异(P= 0.072)，术后7 d及14 d有显著性差异(P=0.01、P= 0.03)。见图2。

图2　各大鼠BBB评分动态变化曲线

2.3残存白质面积

大体形态学观察，A组脊髓形态正常，中央灰质区完整，外周白质区域染色均匀；B、C、D组中央灰质均存在不同面积的空洞，外周白质出现不同数量点状空洞，D组白质区出现大片空洞。A、B、C、D组残存白质面积百分比分别为100％、(26.68±4.05)％、(10.98±3.96)％、(2.66±2.02)％，有显著性差异(P<0.05)。

2.4相关性分析

术后3 d血清pNF-H浓度与术后14 d BBB评分呈负相关(r=-0.987)，与大鼠脊髓残存白质面积百分比呈负相关(r=-0.978)。

3讨论

pNF-H是一种在神经轴突中含量高、稳定性强、神经组织特异性强的高分子蛋白质[7,12]，在脑卒中、脑外伤、脊髓侧索硬化、多发性硬化等中枢神经系统轴突损伤性疾病的评价研究中取得很好的成果[13-16]。脊髓损伤为中枢神经系统轴突损伤性疾病，目前仅有少数关于pNF-H与脊髓损伤关系的报道[17-18]。

本研究显示，大鼠脊髓损伤后，血清pNF-H浓度随时间的变化曲线存在双峰现象，此双峰现象在不同程度脊髓损伤组间一致，两次峰值分别出现在脊髓损伤后12 h及3 d。Shaw等报道大鼠脊髓损伤后血清pNF-H峰值分别出现在术后16 d和3 d[7]。首个峰值出现时间不一致考虑为采血点不同，两个实验在脊髓损伤后24 h内采血点均较少，需要增加采血时间点进一步研究。

对于双峰现象可能的解释如下。

研究证实，创伤性脊髓损伤的病理生理机制包括原发性损伤和继发性损伤[1-2]，本研究中NYU打击器所致的钝挫伤即为原发性损伤；继发性损伤是指外力所造成的脊髓水肿、椎管内小血管出血形成血肿，压缩性骨折以及破碎的椎间盘组织等形成脊髓压迫所造成的脊髓的进一步损害，损伤机制主要有微循环障碍、脊髓低灌注、内源性有害物质的产生等[19]；当大鼠脊髓遭受打击后并出现轴索损伤时，因为血脊髓屏障的存在[20]，pNF-H并不能立即大量释放入血，只能在血脊髓屏障逐渐被破坏后入血，即pNF-H第1个峰值。当原发性损伤所致的pNF-H大量释放入血清而继发性损伤尚不严重时，血清pNF-H逐渐被降解，即出现所测血清pNF-H浓度轻微下降。有研究表明，脊髓损伤后2～3 d时水肿最严重[21]，这种继发性损伤导致轴突大量被破坏，血清pNF-H达到第2次高峰，之后pNF-H被降解。

另有研究表明，脊髓灰质的破坏在脊髓损伤后24 h内达高峰，而白质的破坏一直持续到脊髓损伤后1周[22]，灰质破坏时释放的pNF-H较少，导致第1个高峰，2～3 d时轴突广泛破坏，导致大量pNF-H释放入血清，导致第2个高峰值。

目前支持这两种解释的文献均不少，也可以两种原因同时导致此双峰现象。

NYU打击器打击是目前国际上通用的标准啮齿类动物脊髓损伤造模方法之一。可通过调节撞击杆高度控制啮齿类动物脊髓损伤程度。本研究显示，血清pNF-H浓度在所有时间点均为重度损伤>中度损伤>轻度损伤。BBB评分及残存白质面积百分比等得到证实，评估脊髓损伤严重程度的指标均呈负相关。

本研究中，术后24 h、2 d及2周时血清pNF-H浓度差异未达到差异性。脊髓损伤后2周，血清pNF-H浓度已经接近基线水平，已经接近检测仪的可靠极限，参考价值较差；而在24 h、2 d时无显著性差异的原因，有待进一步研究。

脊髓损伤的评价方法主要有神经功能学评价、影像学评价、神经电生理检查、组织形态学观察、分子生物学等[17-18]。神经功能学评价方法，在临床中应用最广泛的为ASIA评价方法[23]，在动物实验中应用的主要为BBB评分，但它们在脊髓休克期并不能真实反映脊髓的神经功能状况[24-25]。MRI被认为是脊髓损伤诊断的“金标准”，但在超急性期，MRI不能良好显示脊髓的损伤状况；早期患者不宜于大幅度移动也限制了MRI在脊髓损伤方面的应用；一些体内存在磁性金属物质如枪伤的患者不适于行MRI检查[26-27]。神经电生理检查主要包括体感诱发电位、动作诱发电位、肌电图等，操作较简单，但是干扰因素太多，且动作诱发电位在脊髓损伤休克期也不能做出评估，且无分级标准[18]。组织形态学[28]广泛应用于动物实验中，但临床无法应用。

目前研究的分子标记物主要有小分子量的钙结合蛋白S100、神经元特异性烯醇酶(neuron-specific enolase,NSE)及神经微丝蛋白(NF)。Anderson等研究显示，S100及NSE不仅存在于神经细胞中，在其他非神经细胞中也能检测到[13]。Marquardt等[29-30]、Cao等[31]发现，血清中S100及NSE在脊髓损伤后6 h达高峰，24 h降至基线水平，这是因为S100及NSE稳定性较差，容易被蛋白酶水解。NF只存在于神经细胞中，特异性强，且有很强的抗酶解能力，特别是pNF抗酶解能力更强。NF存在3种亚结构，分别为低分子量的神经微丝蛋白(NF-L)、中分子量的神经微丝蛋白(NF-M)以及高分子量的神经微丝蛋白(NF-H)，在神经细胞的分子标记物中，NF-H含量最高，NF-L、NF-M及其他分子标记物含量均较低，pNF-H是评价脊髓损伤很有前景的一项指标。

本研究首次对pNF-H与脊髓损伤程度关系进行动物实验研究。虽然本研究样本量有其他实验参照，但更大样本量可靠性更高；本研究观察时间只有14 d，后肢功能尚不能完全反映最终的运动功能恢复情况，所以设计了组织病理学研究加以弥补。pNF-H稳定性较强，其在体内的降解时间尚无研究阐述，脊髓损伤高峰是否与血清pNF-H高峰一致尚待更多研究证实。

血清pNF-H是一项有潜力的评估脊髓损伤严重程度的指标，虽然目前动物实验及临床实验均开展得较少，但血清pNF-H自身的优势必将吸引更多的研究。

[参考文献]

[1]Botero L,Gomez RM,Chaparro O.Pathogenesis of spinal cord injuries and mechanisms of repair induced by olfactory ensheathing cells[J].Rev Neurol,2013,56(10):521-531.

[2]Yokobori S,Zhang Z,Moghieb A,et al.Acute diagnostic biomarkers for spinal cord injury:review of the literature and preliminary research report[J].World Neurosurg,2015,83(5):867-878.

[3]Liu M,Wu X,Tong M.Effects of ultra-early stage hyperbaric oxygenation on the hind limb bone mineral density in rats after complete spinal cord transection[J].Undersea Hyperb Med,2013,40(1):15-22.

[4]Muradov JM,Hagg T.Intravenous infusion of magnesium chloride improves epicenter blood flow during the acute stage of contusive spinal cord injury in rats[J].Neurotrauma,2013,30(10):840-852.

[6]Sengul G,Coban MK,Cakir M,et al.Neuroprotective effect of acute interferon-beta 1B treatment after spinal cord injury[J].Turk Neurosurg,2013,23(1):45-49.

[7]Shaw G,Yang C,Ellis R,et al.Hyperphosphorylated neurofilament NF-H is a serum biomarker of axonal injury[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,336(4):1268-1277.

[8]Ueno T,Ohori Y,Ito J,et al.Hyperphosphorylated neurofilament NF-H as a biomarker of the efficacy of minocycline therapy for spinal cord injury[J].Spinal Cord,2011,49(3):333-336.

[9]Hayakawa K,Okazaki R,Ishii K,et al.Phosphorylated neurofilament subunit NF-H as a biomarker for evaluating the severity of spinal cord injury patients,a pilot study[J].Spinal Cord,2012,50(7):493-496.

[10]Gruner JA.A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat[J].Neurotrauma,1992,9(2):123-126,126-128.

[11]Young W.Spinal cord contusion models[J].Prog Brain Res,2002,137:231-255.

[12]Shaw G.The use and potential of pNF-H as a general blood biomarker of axonal loss:an immediate application for CNS injury[M]// Kobeissy FH.SourceBrain Neurotrauma:Molecular,Neuropsychological,and Rehabilitation Aspects.Boca Raton，FL:CRC Press，2015.

[13]Anderson KJ,Scheff SW,Miller KM,et al.The phosphorylated axonal form of the neurofilament subunit NF-H(pNF-H)as a blood biomarker of traumatic brain injury[J].Neurotrauma,2008,25(9):1079-1085.

[14]Lewis SB,Wolper RA,Miralia L,et al.Detection of phosphorylated NF-H in the cerebrospinal fluid and blood of aneurysmal subarachnoid hemorrhage patients[J].Cereb Blood Flow Metab,2008,28(6):1261-1271.

[15]Hein Née Maier K,Köhler A,Diem R,et al.Biological markers for axonal degeneration in CSF and blood of patients with the first event indicative for multiple sclerosis[J].Neurosci Lett,2008,436(1):72-76.

[16]Boylan K,Yang C,Crook J,et al.Immunoreactivity of the phosphorylated axonal neurofilament H subunit(pNF-H)in blood of ALS model rodents and ALS patients:evaluation of blood pNF-H as a potential ALS biomarker[J].Neurochem,2009,111(5):1182-1191.

[17]Natori A,Ogata T,Sumitani M,et al.Potential role of pNF-H,a biomarker of axonal damage in the central nervous system,as a predictive marker of chemotherapy-induced cognitive impairment[J].Clin Cancer Res,2015,21(6):1348-1352.

[18]姜树东,洪毅,王彦辉,等.实验性脊髓损伤的观察评定方法[J].中国康复理论与实践,2005,11(12):991-993.

[19]周天健,李建军.脊髓继发性损伤的改变和发生机制[M]//周天健,李建军.脊柱脊髓损伤现代康复与治疗.北京:人民卫生出版社,2006:499-514.

[20]Fang B,Li XQ,Bi B,et al.Dexmedetomidine attenuates blood-spinal cord barrier disruption induced by spinal cord ischemia reperfusion injury in rats[J].Cell Physiol Biochem,2015,36(1):373-383.

[21]Weirich SD,Cotler HB,Narayana PA,et al.Histopathologic correlation of magnetic resonance imaging signal patterns in a spinal cord injury model[J].Spine,1990,15(7):630-638.

[22]Ek CJ,Habgood MD,Callaway JK,et al.Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat[J].Spinal Cord,2010,5(8):12-21.

[23]Schuld C,Wiese J,Franz S,et al.EMSCI Study Group.Rupp R.Effect of formal training in scaling,scoring and classification of the International Standards for Neurological Classification of Spinal Cord Injury[J].Spinal Cord,2013,51(4):282-288.

[24]Curt A,Dietz V.Electrophysiological recordings in patients with spinal cord injury:significance for predicting outcome[J].Spinal Cord,1999,37(3):157-165.

[25]Fisher CG,Noonan VK,Smith DE,et al.Motor recovery,functional status,and health-related quality of life in patients with complete spinal cord injuries[J].Spine,2005,30(19):2200-2207.

[26]Smith SA,Pekar JJ,van Zijl PC.Advanced MRI strategies for assessing spinal cord injury[J].Handb Clin Neurol,2012,109:85-101.

[27]Buxton N.The military medical management of missile injury to the spine:a review of the literature and proposal of guidelines[J].R Army Med Corps,2001,147(2):168-172.

[28]Hu JZ,Wu TD,Zhang T,et al.Three-dimensional alteration of microvasculature in a rat model of traumatic spinal cord injury[J].Neurosci Methods,2012,204(1):150-158.

[29]Marquardt G,Setzer M,Seifert V.Serum biomarkers for experimental acute spinal cord injury:rapid elevation of neuron-specific enolase and S-100 beta[J].Neurosurgery,2006,58(3):E590.

[30]Marquardt G,Setzer M,Theisen A,et al.Experimental subacute spinal cord compression:correlation of serial S100β and NSE serum measurements,histopathological changes,and outcome[J].Neurol Res,2011,33(4):421-426.

[31]Cao F,Yang XF,Liu WG,et al.Elevation of neuron-specific enolase and S-100beta protein level in experimental acute spinal cord injury[J].Clin Neurosci,2008,15(5):541-544.

Correlation between Serum Phosphorylated High-molecular-weight Neurofilament and Severity of Spinal Cord Injury in Rats

HE Jian-gen1,LI Jian-jun2,3,YANG Ming-liang2,3,WU Liang2,3,YANG De-gang2,3
1.Beijing Xiaotangshan Hospital,Beijing 102211,China;2.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China;3.Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Centre,Beijing 100068,China

Correspondence to LI Jian-jun.E-mail:crrc100@163.com

Abstract:Objective To investigate the level of phosphorylated high-molecular-weight neurofilament(pNF-H)after spinal cord injury(SCI),and explore the relationship between pNF-H and severity of SCI.Methods 20 Sprague-Dawley rats were equally divided into control group(group A),mild SCI group(group B),moderate SCI group(group C)and severe SCI group(group D).The level of pNF-H in serum,BBB score and remaining area of white matter were obtained at different time points.Results The level of serum pNF-H in groups B,C and D arrived at peaks 12 hours and 3 days after SCI,and there was significant difference among them(P<0.05).Both BBB score and remaining area of white matter 14 days after SCI negatively correlated with the level of pNF-H 3 days after SCI(r=-0.987 and r=-0.978,respectively).Conclusion The pNF-H increases twice after SCI in rats,and may be associated with the severe of SCI,which can be considered as a biomarker.

Key words:spinal cord injury;neurofilament;molecular biological evaluation;rats

(收稿日期：2015-10-19修回日期：2015-11-17)

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.03.007

[中图分类号]R651.2

[文献标识码]A

[文章编号]1006-9771(2016)03-0274-04