组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对多发性骨髓瘤复发、难治患者骨髓单个核细胞的抑制作用

张　灵　白晓敏　范　凌　张亚芳　吉慧姝

075000 河北北方学院附属第一医院(张　灵，白晓敏，范　凌，吉慧姝)；075000 河北省张家口市建国医院(张亚芳)



组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589对多发性骨髓瘤复发、难治患者骨髓单个核细胞的抑制作用

张灵白晓敏范凌张亚芳吉慧姝

075000 河北北方学院附属第一医院(张灵，白晓敏，范凌，吉慧姝)；075000 河北省张家口市建国医院(张亚芳)

【摘要】目的探讨单用LBH589或联合硼替佐米及地塞米松对多发性骨髓瘤复发、难治患者骨髓单个核细胞的作用。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法，检测LBH589(15、25、50) nmol/L及50 nmol/L分别联合硼替佐米(15、25) nmol/L及地塞米松 (5、10)μmol/L对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞作用24，48 h后的细胞增殖影响；采用流式细胞术测定LBH589对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞细胞周期及细胞凋亡的影响；用Westernblot测定LBH589(15、25、50 nmol/L)对复发、难治患者骨髓单个核细胞作用24 h后组蛋白H4乙酰化的变化程度。结果单用LBH589或联合硼替佐米及地塞米松均能够使复发、难治患者骨髓单个核细胞增殖受到抑制，且与药物剂量和时间变化呈正比例。药物作用于MM复发、难治患者骨髓单个核细胞48 h后，G0/G1期细胞逐渐增加，G2/M期及S期细胞则逐渐降低，细胞在G0/G1期发生阻滞，可观察到细胞凋亡现象，且凋亡程度与药物剂量变化呈正比例，三药联合作用均较单药作用更加显著(P均<0.01)；Westernblot测定显示，不同浓度LBH589对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞作用24 h后组蛋白H4乙酰化的程度上调，且与药物剂量变化呈正比例。结论LBH589能够使MM复发、难治患者骨髓单个核细胞增殖受到抑制，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡，且三药联合对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞有加强抗瘤细胞作用。

【关键词】LBH589；MM复发、难治患者骨髓单个核细胞；组蛋白乙酰化

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:407～410)

多发性骨髓瘤(multipie myeloma，MM)是发生在浆细胞的恶性肿瘤，骨髓瘤细胞异质性强，容易发生耐药现象，导致复发、难治率上升，至今尚无法完全治愈[1]。因此需要进一步研发新的药物来降低复发和难治率。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以使组蛋白去乙酰化酶的活性受到抑制，促进靶细胞中组蛋白恢复乙酰化，从而启动某些特异性基因的表达，抑制肿瘤细胞的生长[2-5]。已有研究证实，LBH589是1类新型的异羟肟酸类组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在体外作用于MM细胞后可促进组蛋白乙酰化，诱导细胞凋亡，并且对地塞米松耐药的MM1R细胞有明显的抑制作用[6-8]，但其对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞有无影响尚未见报道。本研究旨在探索LBH589对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞的作用，同时也探讨其与硼替佐米及地塞米松联合在体外抗MM复发、难治患者骨髓单个核细胞的加强作用。

1材料与方法

1.1试剂与材料

LBH589为美国Biovision公司原装进口试剂，硼替佐米购于西安杨森公司，地塞米松注射液为上海通用药业股份有限公司产品，β-actin抗体、组蛋白H4(histone H4)抗体均为美国Cell Signaling公司产品，2PMI1640培养液购于博士德公司，胎牛血清为杭州四季青公司产品，碘化丙啶(PI)试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，人淋巴细胞分离液为上海生工生物工程有限公司产品，MTT为3igma公司产品。

1.2标本来源

按Durie-Solmon分期系统，从河北北方学院附属第一医院血液科选出12例不同类型的MM复发、难治患者，其中男性4例，女性8例，中位年龄53.4岁；，其中ⅡA期患者3例，ⅡB期患者2例，ⅢA期患者3例，ⅢB患者4例。所有病例均符合中国多发性骨髓瘤诊治指南(2013年修订)诊断标准。

1.3方法

1.3.1MM复发、难治患者骨髓单个核细胞的分离和培养无菌条件下行骨髓穿刺术在髂后上嵴抽取骨髓液15～20 mL，肝素抗凝。加入一定量的PBS后1 500 r/min 离心约10 min，把骨髓中的脂肪组织消除，再放入等量的D-Hanks液混匀。将淋巴细胞分离液放入另一无菌离心管，再缓慢加入骨髓液，骨髓液与淋巴细胞分离液的体积比为1∶2。以2 000 r/min 离心10 min，将中间的白细胞层用毛细吸管吸取后加入另一试管中，用PBS洗涤3遍。将以上分离出的骨髓单个核细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，置于5%CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中进行培养，2～3天换液并传代1次，收集对数生长期的细胞用来测定。

1.3.2药物处理MM复发、难治患者骨髓单个核细胞

根据参考文献[5]中浓度和预实验结果，将浓度分别为0、15、25、50 nmol/L LBH589，浓度分别为15、25 nmol/L硼替佐米，注射液浓度为5、10 μmol/L，地塞米松，加入对数生长期的细胞24或48 h后收集细胞并进行洗涤，用于实验。

1.3.3MTT法检测细胞增殖活性收集对数生长期的骨髓单个核细胞，将不同浓度药物加入接种了以细胞密度1×105/ml的96孔培养板，用无血清的RPMI 1640补足未加药物浓度组，设置每孔总体系0.2 ml，分别作用24 h、48 h，再加入MTT工作液20 μl/孔(终浓度0.5 mg/ml)，置37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中孵育4 h，1 000 r/min离心，后吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 200 μl，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(A)。

细胞增殖抑制率(%)=(A对照组-A实验组)/(A对照组-A未加药物浓度组)×100%

1.3.4流式细胞术检测MM复发、难治患者骨髓单个核细胞周期及细胞凋亡收集对数生长期的骨髓单个核细胞，将不同浓度的药物加入接种于细胞密度为1×106/mL的24孔板，同时设未加药物浓度组，48 h后收集各组细胞，离心并去掉上清液，用4 ℃预冷的PB3洗涤2次，1 000 r/min，4 ℃离心7 min，去上清液。将细胞重悬于1×缓冲液，将5 μl PI加入100 μl细胞，混匀后室温避光反应15 min，再加入300 μl×缓冲液，然后用流式细胞仪检测，实验重复3次，取平均值。

1.3.5Westernblot检测组蛋白H4乙酰化程度收集对数生长期的骨髓单个核细胞，将不同浓度的LBH589加入接种于细胞密度为1×107/ml的24孔板，同时设未加药物浓度组，24 h后收集各组细胞，用超声波细胞粉碎机处理(160 W，持续3 s，间隔5 s，共3次)，4 ℃ 10 000×g离心10 min，取上清液，Bradford法测蛋白质浓度后-70 ℃冻存备用。等量蛋白行100 g/LSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电转移后将PVDF膜放入密闭盒中，加入一抗，4 ℃过夜。用1×TBST洗膜3～4次，每次5 min。PVDF膜置于二抗中，杂交炉中室温温育1 h。用1×TBST洗膜3次，每次5 min，β-actin作为内参对照，参照化学发光试剂盒说明书进行操作。

1.4统计学分析

2结果

2.1单用LBH589或联合硼替佐米及地塞米松对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞增殖作用的影响

MTT法检测细胞增殖表明，单用LBH589及三药联合均可以使MM复发、难治患者骨髓单个核细胞的增殖受到抑制，呈时间和浓度依赖性，且有明显差异(P均<0.01)，逐渐延长时间及增加浓度剂量，抑制效果更加明显，三药联合抑制效果均较单药抑制效果明显(P<0.01)(表1)。

表1　单用LBH589或三药联合对MM复发、难治患者

注：与未加药物组比较，*为P<0.05。

2.2LBH589促进MM复发、难治患者骨髓单个核细胞组蛋白乙酰化

LBH589(0、15、25、50 nmol/L)作用于MM复发、难治患者骨髓单个核细胞24 h，随着药物剂量的增加，组蛋白H4乙酰化程度逐渐上调；且呈浓度依赖性(P<0.01)(表2，图1)。

表2　LBH589作用MM复发、难治患者骨髓单个核细胞

注：与未加药物组比较，*为P<0.05。

1为未加药物组；2为15 nnomL/L LBH589处理组；3为25 nnomL/L LBH589处理组；4为50 nnomL/L LBH589处理组。

图1Western blot检测结果

2.3单用LBH589或联合硼替佐米及地塞米松对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞周期及凋亡的影响

不同浓度LBH589作用MM复发、难治患者骨髓单个核细胞48 h，与未加药物组相比，随着药物剂量的不断升高，G0/G1期细胞逐渐增加，而G2/M期及S期细胞则逐渐降低，细胞在G0/G1期发生阻滞。作用48 h后，未加药物组细胞未见显著凋亡，而药物处理组的细胞凋亡率越来越高，呈浓度依赖性，三药联合作用处理48 h较单药组细胞凋亡率显著增高(P值均<0.05)(表3)。

3讨论

研究表明，LBH589 是1种新型的HDAC抑制剂，体外试验已证实它对卵巢癌、淋巴瘤等实体瘤，以及多发性骨髓瘤耐药细胞均有抑制增殖、诱导再分化和促进凋亡作用，且具有效果强、毒性低的特性，与一些药物联合应用能够加强抗瘤细胞效应[9-13]。

结果表明单用LBH589及三药联合均可以使MM复发、难治患者骨髓单个核细胞的增殖受到抑制，且逐渐延长时间及增加浓度剂量，抑制效果更加明显，三药联合抑制效果均较单药抑制效果明显，且50 nmol/L LBH589+25 nmol/L硼替佐米+10 μmol/L地塞米松组抑制效果最强，这明显表明LBH589与其它两药联合具有共同抗瘤细胞效应。

另外，单用LBH589或联合硼替佐米及地塞米松均能够使MM复发、难治患者骨髓单个核细胞在G0/G1期发生阻滞，且随着药物剂量的增大，该期细胞逐渐增加，S期细胞则逐渐降低，且伴随药物剂量的不断增加，阻滞作用越来越强，呈药物浓度依赖性变化，由此表明细胞凋亡可能发生在G1期。作用48 h后MM复发、难治患者骨髓单个核细胞发生了凋亡现象，且凋亡率随着药物剂量的增加逐渐升高，也呈药物浓度依赖性，表明LBH589具有使MM复发、难治患者骨髓单个核细胞周期发生阻滞，促进细胞凋亡的作用。

表3　单用LBH589或三药联合对MM复发、难治患者骨髓单个核细胞48 h后细胞周期分布及凋亡率±s，%)

注：与未加药物比较，*为P<0.05。

Western blot实验表明，使用不同浓度LBH589作用MM复发、难治患者骨髓单个核细胞24 h后，组蛋白H4乙酰化程度随着药物剂量的增大越来越明显，表明LBH589能够促进MM复发、难治患者骨髓单个核细胞中组蛋白高度乙酰化，从而克服肿瘤，使机体恢复正常。

综上所述，LBH589通过提高组蛋白乙酰化程度来抑制MM复发、难治患者骨髓单个核细胞增殖、阻滞细胞周期，促进细胞凋亡，从而克服肿瘤。LBH589有望成为治疗MM的一类开创性的新型药物，会成为一种重要的MM治疗选择。

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(编辑：吴小红)

The Inhibitive Effect of Histone Deacetylase Inhibitors LBH589 On Bone Marrow Mononuclear Cells of Patients with Relapsed or Refractory Multiple Myeloma

ZHANGLing，BAIXiaomin，FANLing，etal.

FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity，Zhangjiakou,075000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of LBH589 alone or combined with bortezomib and dexamethasone on bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma.MethodsMethyl thiazolyl tetrazolium(MTT)was used to detect the effect of LBH589(15，25，50) nmol/L and 50nmol/L respectively combined with bortezomib(15，25) nmol/L and dexamethasone(5，10)mol/L on cell proliferation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma 24 h and 48 h later；flow cytometry was used to detect the effect of LBH589 on cell cycle and apoptosis of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma；Westernblot was used to detect the effect of LBH589(15，25，50 nmol/L)on the changes of degree of histone H4 acetylation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma 24 h later.ResultsLBH589 alone or combined with bortezomib and dexamethasone were able to inhibit proliferation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma，and its relationship with drug dose and time was direct ratio.48 h after bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma treated with drugs，G0/G1 phase cells gradually increased，G2/M phase and S phase cells gradually decreased，G0/G1 phase occurred cell block，cell apoptosis was observed，and apoptosis degree was positively proportional with drug dose，combined effect of the 3 drugs was more significant than any single drug(P all<0.01)；Westernblot showed that degree of histone H4 acetylation increased 24 h after different concentrations of LBH589 on bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma，and it was positively proportional with drug dose.ConclusionLBH589 can inhibit proliferation of bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma，arrest cell cycle，promote apoptosis，and the combination of 3 drugs can strengthen the anti-tumor effects of cells.

【Key words】LBH589；Bone marrow mononuclear cells of patients with relapsed or refractory multiple myeloma；Histone acetylation

(收稿日期2015-05-21修回日期 2015-12-01)

中图分类号：R739.42

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)03-0407-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.018