重组蛋白P53联合紫杉醇在宫颈癌中的抑制作用

权效珍　覃小敏　刘　韵

441021 湖北省襄阳市中心医院



重组蛋白P53联合紫杉醇在宫颈癌中的抑制作用

权效珍覃小敏刘韵

441021 湖北省襄阳市中心医院

【摘要】目的探讨P53联合紫杉醇在宫颈癌中的抑制作用。方法利用宫颈癌细胞系HeLa细胞进行实验研究，利用MTT实验对单独加入P53重组蛋白、紫杉醇和P53联合紫杉醇对细胞增殖进行检测，两者均不加为对照组，同样的设计思路对细胞单克隆进行检测，最后用western-blot进行4种细胞蛋白的检测。结果重组蛋白联合紫杉醇时抑制宫颈癌细胞的生长，且抑制作用具有统计学差异；细胞单克隆形成数目也是减少，在初步探讨其作用机制时发现VEGF表达减少。结论P53重组蛋白联合紫杉醇能有效抑制宫颈癌细胞生长，其潜在作用机制是抑制VEGF的表达。

【关键词】VEGF；宫颈癌；P53；紫杉醇

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:359～361)

早期的宫颈癌通常通过手术切除或者放疗等措施进行治疗，但是晚期的恶性宫颈癌没有手术切除机会，而放疗效果低且复发率高，同时还会带来身体上的损伤[1-2]。许多事实证明，合适的化疗药物能够减小肿瘤体积和数量，为手术治疗提供一个良好的环境，但是，众所周知的药物耐药性是化疗药物的一个瓶颈，如何降低机体对药物的耐药性这是一个问题[3-4]。

有研究表明，野生型P53基因的突变在宫颈癌发生发展中有着重要作用，而且肿瘤耐药性也与野生型P53基因的突变有关系[5-6]。本文主要集中在研究人源性P53联合紫杉醇在宫颈癌细胞株中的作用，而且我们探讨P53联合紫杉醇是否通过VEGF这一途径对宫颈癌细胞产生作用。

1材料与方法

1.1细胞资料

宫颈癌细胞HeLa购买于ATCC，37 ℃，5%CO2恒温箱中培养，DMEM培养，在细胞处于对数期时用于实验。

1.2方法

1.2.1MTT检测①接种细胞:用含10%胎小牛血清的培养液配成单细胞悬液，每孔1 000～10 000细胞，接种96孔板，每孔体积200 μl。重组蛋白P53用量为5×107vp/ml，紫杉醇用量为3 μg/ml。②待TEC贴壁后，每孔加MTT(噻唑蓝)溶液(5 mg/ml用PBS配制pH=7.4)20 μl，继续孵育4 h终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心再吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μl DMSO振荡10 min，使结晶物充分融解。③选择490 nm波长酶标仪上测定各孔光吸收值记录结时间，横坐标吸光值，纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.2平板克隆实验将细胞悬液计数后接种约100个细胞于细胞培养皿中，待细胞长成肉眼可见的克隆后开始实验，弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5 mL固定15 min。然后去固定液，加适量结晶紫染色液染色，10～30 min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。克隆形成反映细胞群体依赖性和增殖能力2个重要性状。

1.2.3SDS-PAGE电泳:①上样前将胶板下的气泡赶走。②蛋白样品调至等浓度后上样，蛋白上样量保证在一定浓度上进行，同时加入6 μl蛋白marker。③以初始电压为80 V时跑浓缩胶，然后升至120 V跑分离胶。④在目的蛋白泳动至距胶下缘1 cm以上结束。浸泡PVDF膜：将PVDF膜泡在甲醇中5 min。

转膜:恒流250 mA，90 min，然后将膜从电转槽中取出，TBST稍加漂洗，5%脱脂牛奶封闭液中缓慢摇荡1 h。TBST稍加漂洗，一抗孵育过夜，第2天将其放在常温复温40 min，然后TBST漂洗膜3次，每次5 min。根据一抗来源选择二抗，室温轻摇1 h。二抗孵育结束后，用TBST漂洗膜3次，每次5 min。对洗后的PVDF膜发光显影，用ECL发光液进行发光显影，配置方法为A液与B液1∶1进行配置，进行发光显影。

1.3统计学处理

应用SPSS 11.0统计软件包处理，采用t检验，Pearson相关分析，χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1重组蛋白联合紫杉醇抑制宫颈癌细胞的生长

在人宫颈癌细胞株中单次加入紫杉醇和单次加入P53，作为实验控制组，不加为对照组，联合P53和紫杉醇加入宫颈癌细胞株中，单独加入P53或紫杉醇时抑制作用不明显，当两者联合作用时，其抑制作用明显，且与对照组相比差异明显(P<0.001)，见图1。

图1　重组蛋白P53和紫杉醇对宫颈癌细胞生长的抑制作用

2.2重组蛋白联合紫杉醇抑制宫颈癌细胞的克隆形成

上述我们已经证实在联合加入P53重组蛋白和紫杉醇后期细胞生长明显受到抑制，但是MTT实验室检验的是一群细胞的增殖能力，所以接下来我们对单个细胞的增殖能力进行检测。在平板克隆中我们发现在加入单个或不加P53、紫杉醇时其克隆形成较加入P53重组蛋白和紫杉醇时明显，在加入P53重组蛋白和紫杉醇后其克隆形成明显减少，见图2。

图2　重组蛋白P53和紫杉醇对宫颈癌细胞的克隆

2.3在同时加入P53重组蛋白和紫杉醇时细胞VEGF表达量减少

在我们研究中我们已经证实P53和紫杉醇的联合作用能有效降低宫颈癌细胞的增殖能力，但是如何引起这一现象的发生呢？据我们所知，在肿瘤治疗中有一种治疗策略为肿瘤饥饿疗法，而在临床研究中VEGF是靶向血管的影响因子，其作用方式就是通过减少血管的生成进而达到饥饿肿瘤的方法。所以在以上猜想后我们进行了VEGF的检测，在单独加入P53重组蛋白或者紫杉醇时VEGF表达量相比于对照组有所降低，但是降低效果不是很明显，当P53重组蛋白和紫杉醇联合用药后VEGF的表达量相比于其他3组明显降低，见图3。

图3　VEGF-C在宫颈癌细胞中的表达

3讨论

宫颈癌是人类疾病中恶性程度较高的一类疾病，其主要是易发生转移，特别是淋巴结的转移，其是导致其难治愈的一个主要原因[7]。转移的肿瘤通过血液、淋巴管，进而形成多种其他肿瘤，淋巴管的转移包括一系列的复杂过程，包括，①原位癌恶性肿瘤细胞扩散至旁边淋巴管；②肿瘤细胞通过淋巴管转运至邻近的淋巴结；③肿瘤细胞在淋巴结中的着落；④转移性的肿瘤在淋巴结中的扩散[8-10]。P53基因作为肿瘤相关原因已经被广大科研工作者所研究[11]。有研究表明P53基因不仅仅和宫颈癌的发生发展有关系，还和其药物作用有关系。紫杉醇是临床上较为常见的肿瘤药物，其产于太平洋紫杉山桃花心木，聚合作用和解聚作用是微管形成的重要因素，而微管形成是染色质形成的重要原因，紫杉醇与微管β部位链接后阻止细胞进行扩增，导致细胞走向凋亡[12-14]。紫杉醇在治疗卵巢癌、宫颈癌等其他恶性肿瘤中发挥重要作用[15]。但是P53联合紫杉醇的作用还未见详细报道。

我们的实验证实，单独使用P53重组蛋白或者紫杉醇时宫颈癌细胞HeLa细胞在细胞生长方面有所下降，但是其抑制作用不是很明显，当P53重组蛋白联合紫杉醇时其抑制细胞生长作用明显。我们也对肿瘤生长必须的表皮生长因子进行了检测，发现在联合给药时细胞中VEGF表达量明显减少。本研究创新点在于首次揭示了P53和紫杉醇可以联合用来抑制宫颈癌细胞进行生长，也初步解释了其抑制机制，但美中不足之处在于，我们没有详细的解释为什么是VEGF影响肿瘤细胞，这一点还需我们更多的实验数据来验证。

参考文献

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(编辑：甘艳)

The Inhibitory Effect of Recombinant Human P53 Combined with Paclitaxel on Human Cervical Cancer Cell

QUANXiaozhen,QINXiaomin,LIUYun.

HubeiUniversityofArtsandScienceAffiliatedXiangyangCentralHospital,Xiangyang,441021

【Abstract】ObjectiveTo detect the inhibitory effect of recombinant human P53 combined with paclitaxel on human cervical cancer cell and its mechanism.MethodsHuman HeLa cell was used to detect the cell proliferation,and add P53 or paclitaxel alone,and both of them as experiment,blank as a control,the congenic assay was detected,and the protein was detected by western-blot.ResultsThe growth of HeLa cells decreased after add P53 and paclitaxel,the P53 and paclitaxel alone also decreased，P53 and paclitaxel had statistical difference,P<0.001,and the ability of congenic decreased after add P53 and paclitaxel,and the expression of VEGF decreased.ConclusionThe inhibitory ability of recombinant human P53 combined with paclitaxel on human cervical are efficient,its potential mechanism of action is inhibition of the expression of VEGF.

【Key words】VEGF-C;Cervical cancer;P53;Paclitaxel

(收稿日期2015-06-09修回日期 2015-09-28)

中图分类号：R737.33

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)03-0359-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.004

通讯作者：刘韵