羟基红花黄色素A对小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用

高　亭　蒋引娣　李　敏　何小鹏

712000 陕西中医药大学(高　亭);712000 咸阳市中心医院(高　亭，蒋引娣，李　敏,何小鹏)

羟基红花黄色素A对小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑制作用

高亭蒋引娣李敏何小鹏

712000 陕西中医药大学(高亭);712000 咸阳市中心医院(高亭，蒋引娣，李敏,何小鹏)

【摘要】目的研究羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)对C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤的血管抑制作用。方法C57BL/6近交系小鼠30只，造模后，分为5组，每组6只，分别使用生理盐水、环磷酰胺(CTX)及HSYA(分低、中、高3个剂量)作用于动物模型。观察各组肿瘤体积大小，分析小鼠生长曲线，并在造模第22天处死所有小鼠，无菌条件下剥取瘤组织进行HE染色,观察不同浓度HSYA在不同视野下对肿瘤血管的抑制情况。结果HSYA中、小剂量组对小鼠移植瘤血管生成有一定抑制作用。结论中药羟基红花黄色素A(HSYA)对Lewis肺癌小鼠移植瘤血管生成有一定的抑制作用。

【关键词】羟基红花黄色素A；Lewis肺癌移植瘤；血管生成；HE染色

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:356～358)

肺癌仍是世界上最致命的肿瘤，2010年，在美国因肺癌死亡的人数约有157 300人，其中15 000～20 000人从未有过吸烟史[1-2]。尽管在过去二十年肺癌治疗方式取得了长足的进展，但是长期生存者却很少：只有约10%的患者肺癌得到了缓解。新生血管在肿瘤的生成过程中起着重要的作用，对于其发生机制一直在不断的研究。在前期的研究[3]当中本课题组人员发现羟基红花黄色素A(HSYA)对血管内皮生长因子的表达具有一定的抑制作用，进而证明HSYA对肿瘤血管生成是有一定抑制作用的，但是在病理改变中是否可以更直观的看到，本课题组在新的实验中对肿瘤组织进行HE染色后进行显微镜观察，以获得个直观的病理结果。

1材料与方法

1.1动物及细胞株

30只C57BL/6雄性小鼠，体重18～20 g，周龄6～8周，由第四军医大学实验动物实验室提供;小鼠Lewis肺癌瘤株由上海细胞所购置。

1.2药物与试剂

药物及主要试剂环磷酰胺(CTX)，购自江苏恒瑞股份有限公司，200 mg/支;HSYA标准品，购自上海顺勃生物工程技术有限公司，纯度:HPLC≥98.4%;10% 的中性甲醛溶液、脱蜡、梯度酒精脱水、苏木精、1%盐酸酒精、伊红、中性树胶由咸阳市中心医院病理科提供。

1.3方法

1.3.1细胞培养将小鼠Lewis肺癌细胞置于含10%胎牛血清及DMEM的完全培养液中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，2 d更换1次培养液，0.25%胰蛋白酶消化传代。药物配置HSYA 标准品，用生理盐水配制28、56及112 mg/L溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，无菌分装，-20 ℃冷冻保存(HSYA 遇热易分解)。阳性药CTX 用生理盐水配成2 g/L的溶液。造模把瘤细胞株传代至足够数量后，待贴壁的细胞处于对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化于倒置显微镜下计数，当细胞活力大于95%，调整浓度，配制成1×107mL-1单细胞悬液，按0.2 mL/只接种于小鼠侧肋腹皮下，复制小鼠Lewis 肺癌移植瘤模型。动物分组及给药瘤株接种24 h 后，将小鼠采用计算机随机数字编排分为5组，每组6只。分为对照组、CTX组(25 mg/kg)及HSYA大、中、小剂量组(1.40、0.70、0.35 mg/kg)。瘤株接种第2 天开始，HSYA大、中、小剂量组分别腹腔注射相应浓度药物(2次/d);对照组给予腹腔注射等量灭菌生理盐水(2次/d);CTX组为瘤株接种第2天开始腹腔注射CTX 25 mg/kg(1次/2 d)。

1.4观察项目

1.4.1HSYA对C57BL/6荷瘤小鼠生活状况的影响

用药第2日开始对小鼠活动情况，饮水、进食、肿瘤破溃情况况进行观察并记录。

1.4.2HSYA对Lewis肺癌移植瘤血管生成的病理影响第22 天，处死全部小鼠，取肿瘤组织，10%中性甲醛固定、石蜡包理，5 μm连续切片。采用HE染色法染色后，分别对每张切片观察5个不同视野，观察每个实验中肿瘤血管生成情况。

2结果

2.1HSYA对C57BL/6荷瘤小鼠生活状况的影响

用药第20天生理盐水组小鼠可见肿瘤破溃、出血，小鼠体型消瘦，不喜活动，移动迟缓，具有明显的恶液质体征，饮水、进食明显减少，毛色灰暗；HSYA小剂量组小鼠可见肿瘤突出皮肤，但无破溃及出血点，小鼠活动略受限，毛色光滑；HSYA大、中剂量组小鼠可见肿瘤明显突出皮肤表面，有明显出血点，个别小鼠有明显破溃，小鼠活动稍迟缓，饮水、进食可。CTX组小鼠可在皮下触及黄豆大小突起，不能用游标卡尺测及，小鼠活动正常，无明显功能障碍(图1)。

2.2各组小鼠生存期的比较

各组57/6小鼠治疗观察120天，统计生存时间，应用SPSS 17.0统计学软件，使用Kaplan-Meier比较各组生存差异，得出各组中位生存率及95%可信区间，见表1。

图1　C57BL/6小鼠皮下接种Lewis肺癌细胞肿瘤生长曲线

组别n平均生存期/天中位生存期/天95%可信区间下限上限生理盐水组638±8.14222.154.2CTX组6101.7±14.711572.8128.4HSYA大剂量640.8±13.31514.866.9HSYA中剂量640.1±6.04828.351.8HSYA小剂量651.2±8.55138.968.4

2.3HSYA对Lewis肺癌移植瘤血管生成的HE染色表现

光学显微镜下可见大量Lewis肺癌细胞紊乱排列，形态不一，大小不等，细胞核蓝色深染。生理盐水组肿瘤细胞密集分布并侵入血管管腔；HSYA大剂量组可见以大血管为主，血管周围有癌细胞聚集，血管壁被癌细胞破坏，管腔内可见癌细胞浸润，且可见明显的癌巢形成；HSYA中剂量组可见散在血管形成，管壁周围亦被肿瘤细胞所包围，且有个别管壁被肿瘤细胞所破坏；HSYA小剂量组癌细胞弱密集，无明显血管生成；CTX 组肿瘤细胞有较多坏死,血管生成少见。

3讨论

中医认为肺癌为正气不足，邪气内侵致使血瘀、痰凝等病理变化壅滞于脏腑经络而形成[3]。肿瘤的血管形成是导致血瘀、痰凝主要原因，亦是导致肿瘤生长与侵袭及转移的重要因素，抑制肿瘤血管生成是治疗肿瘤的重要方法。本研究发现，小剂量HSYA作用于荷瘤小鼠，能有效抑制小鼠移植瘤的生长，但其治疗效果较阳性对照组(CTX组)较差，这可能是因为CTX对早期处于分裂期的癌细胞有较大的杀伤作用，同时又具有抑制肿瘤血管生成的作用[4]。肿瘤组织的病理切片HE染色后亦显示，HSYA 大剂量组血管生成较多，且以大血管为主，这是因为HSYA大剂量情况下主要表现为活血化瘀的作用，有利于肿瘤血管的生成。而HSYA小剂量组未见明显血管生成。观察发现经HSYA中、小剂量组干预的荷瘤小鼠生存质量明显好于生理盐水组，所以HSYA中、小剂量在抑制小鼠移植瘤生长的同时为小鼠带来了生存优势。Xi等[5]研究证实HSYA对裸鼠人胃腺癌BGC-823移植瘤血管生成有一定的抑制作用。本研究同样显示，移植瘤经HSYA治疗后，瘤组织的血管生长不及生理盐水组多，这与奚胜燕等的研究一致。

研究显示肿瘤在生长到1～2 mm左右是就需要通过肿瘤的新生血管来为肿瘤提供足够的养分[6]，而肿瘤血管形成是通过一些列复杂的过程实现的，如内皮细胞的迁移、细胞基质的降解等。应用药物干预肿瘤血管生成的任何一个关节均可以导致肿瘤血管生成障碍，本研究人员[7]在前期研究中发现HSYA可以有效抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达，从而抑制了肿瘤新生血管的形成。本次病理结果更进一步揭示了HSYA对血管抑制作用的具体表现。

因此，通过病理分析我们可以得出HSYA对肿瘤血管生成有一定抑制作用，这与我们前期[7]测定VEGF表的结果相一致。HSYA对肿瘤生成的其他分子机制是否仍有抑制作用，我们将在下一步的课题研究中继续深入研究。

参考文献

[1]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer Statistics,2010〔J〕.CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300.

[2]Thun MJ,Henley SJ,Burns D,et al.Lung cancer death rat-

es in lifelong nonsmokers〔J〕.J Natl Cancer Inst,2006,98(10):691-699.

[3]吾麦尔江·玉素甫.中西医结合治疗肺癌52例临床疗效观察〔J〕.中医中药，2010，17(6)：84-85.

[4]顾汝军,王岭,姚青,等.环磷酰胺抗血管生成化疗抑制鼠S180皮下肉瘤血管形成的作用〔J〕.第四军医大学学报,2008,29(1):74-76

[5]Xi SY,Zhang Q,Liu CY,et al.Effects of hydroxy safflower yellow-A on tumor capillary angiogenesis in transplanted human gastric adenocarcinoma BGC-823 tumors in nude mice〔J〕.J Tradit Chin Med,2012,32(2):243-248.

[6]Folklnan J.Angiogenesis in cancer,vascular,rheumatoid a-

nd other disease〔J〕.Nat Med,1995,1(1):27-31.

[7]谢军平,高亭,李环羽，等.羟基红花黄色素A对小鼠Lewis 肺癌移植瘤的抑制作用及VEGF 表达的影响〔J〕.广东医学,2014,35(1):36-38.

(编辑：吴小红)

Anti-tumor Effect of Hydroxysafflor Yellow A on Transplanted Tumor of Lewis Lung Cancer Mice

GAOTing,JIANGYindi,LIMin,etal.

ShaanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,XianyangCentralHospital,Xianyang,712000

【Abstract】ObjectiveTo study the inhibitive effect of hydroxysafflor yellow A on transplanted tumor of Lewis lung cancer in C57BL/6 mice.MethodsThe model of C57BL/6 mice bearing Lewis lung cancer was established by subcutaneous seeding of Lewis lung cancer cells,and randomly divided into 5 groups(n=6).Tumor-bearing mice were injected with normal saline,cyclophosphamide(CTX)or hydroxysafflor yellow A (low,medium or high dose)in each group.All mice were sacrificed on day 22nd under aseptic condition for the rumor collection.The transplanted tumors use hematoxylin-eosin staining.Different concentrations of hydroxysafflor yellow A inhibition of tumor blood vessels were observed.Results Small dose and medium dose hydroxysafflor yellow A can inhibit angiogenesis in transplanted tumor of mice.ConclusionHydroxysafflor yellow A can inhibit tumor angiogenesis of Lewis lung cancer in mice.

【Key words】Hydroxysafflor yellow A；Transplanted tumor of Lewis lung cancer;Angiogenesis;Hematoxylin-eosin staining

(收稿日期2015-04-10修回日期 2015-10-13)

中图分类号：R734.2

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)03-0356-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.003

基金项目：陕西省教育厅科学研究项目(编号：14JK1208)