大鼠乳腺癌骨转移模型中PI3K/Akt信号通路参与诱导疼痛

袁翠堂　丁　罡　廖志军　姜　峰　叶　品　陈思宇

200092 上海交通大学医学院附属新华医院(袁翠堂，丁　罡，廖志军，陈思宇)；202150 上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院(袁翠堂，丁　罡，廖志军，姜　峰，叶　品)



·基础研究·

大鼠乳腺癌骨转移模型中PI3K/Akt信号通路参与诱导疼痛

袁翠堂丁罡廖志军姜峰叶品陈思宇

200092 上海交通大学医学院附属新华医院(袁翠堂，丁罡，廖志军，陈思宇)；202150 上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院(袁翠堂，丁罡，廖志军，姜峰，叶品)

【摘要】目的探讨骨癌痛大鼠模型中PI3K/Akt信号通路参与痛觉过敏的产生和维持及其脊髓机制。方法Wistar大鼠，体重在180～200 g，将大鼠随机分为3组：癌痛模型组(A组)、假手术组(B组)、正常组(C组),A组大鼠左侧胫骨髓腔内单次注入 Walker256 乳腺癌细胞建立大鼠胫骨癌痛模型，B组大鼠左侧胫骨注入等量生理盐水，C组做不给药处理。A组造模后第7天，评估筛选成模的大鼠，随机分为3组：癌痛组(A1组)、癌痛+NS组(A2组)、癌痛+抑制剂组(A3组)。正常对照组(C组)随机分为2组：空白对照组(C1组)、空白+抑制剂组(C2)。A3组和C2组分别在第13、14、21天鞘内注射Akt抑制剂GSK690693，A2组在第13、14、21天鞘内注射等量生理盐水，A1组、B组、C1组均不给药处理。在第0、7、14、21天，分别检测大鼠机械性缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩腿潜伏期(thermal withdrawal latency,MWT)。第21天行为学测试后处死大鼠，取大鼠脊髓L4～L6区段，用免疫组化及Western blot检测大鼠脊髓的磷酸化Akt(p-Akt)水平。结果实验观察到大鼠的MWT和TWL均显著降低，第7天及14天A1组、A2组、A3组及B组分别与C1组比较，P<0.05，第21天A3组与A1组、A2组分别比较，P<0.05。与C1组比较，骨癌痛模型组大鼠脊髓背角p-Akt表达增强，鞘内注射Akt抑制剂可降低脊髓背角p-Akt的表达。结论PI3K/Akt信号通路参与了骨癌痛的中枢敏化，在大鼠骨癌痛发生发展过程中起着重要作用。

【关键词】PI3K/Akt；脊髓；大鼠

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:349～352)

疼痛是是中晚期恶性肿瘤患者最常见的临床症状之一，晚期癌症患者疼痛的发生率为70%～90%[1]。癌症疼痛从生理、心理、精神及社会等方面不同程度降低肿瘤患者的生活质量[2]。PI3K-Akt信号转导通路是体内重要的信号通路之一，研究表明，该信号通路参与了病理性疼痛的发生发展过程。PI3K-Akt信号通路激活后可以诱导和维持不同程度的痛敏反应。通过研究这一信号通路，有望为病理性疼痛的临床治疗提供新的靶点，但是有关这一信号通路在大鼠乳腺癌骨转移疼痛中的作用尚不明确。本研究通过观察鞘内注射Akt抑制剂GK690693对大鼠骨癌痛的影响，了解PI3K/Akt抑制剂在骨癌痛的脊髓机制中的作用。

1材料与方法

1.1实验材料

异氟烷(鲁南贝特制药有限公司)，水合氯醛(10%)、医用碘伏、无菌棉签、止血钳等(上海新华医院崇明分院骨科提供)，1 ml 注射器针头、微量进样器、医用骨水泥等(上海新华医院崇明分院骨科提供)，Walker256 乳腺癌细胞株(受赠于复旦大学医学院王彦青教授)。Akt抑制GSK690693(美国Selleck公司)，Vonfrey 纤维丝(Stoelting公司,美国)，小动物麻醉机(美国matrx马特)。

1.2动物分组

Wistar大鼠，体重在180～200 g。将90只大鼠随机分为3组：癌痛模型组(A组60只)、假手术组(B组10只)、正常组(C组20只)。A组大鼠左侧胫骨髓腔内注入20 μl Walker256 细胞(1×108/ml)，B组大鼠左侧胫骨髓腔内注入20 μl 生理盐水，其余操作同A组。C组不做任何干预。

造模后第7天，评估癌痛动物模型，再分组。 根据大鼠一般情况(生长情况，体重变化)、行为学表现及影像学评估癌痛组大鼠造模是否成功：①造模术后第7天大鼠生长情况良好，体重明显增长，与C组类似，甚至增长体重超过对照组;②造模术后第7天MWT及TWL未出现下降，反而升高；③影像学X线摄片大鼠左后胫骨表现：局部骨质透亮度减低，未见明显骨质破坏。同时满足这3个条件中的两个条件认为大鼠造模失败，将其剔除出癌痛模型组，剔除出本实验，第7天从造模所有60只大鼠中筛选出30只造模成功的大鼠。再分组：第7天后，将A组成膜的30只大鼠随机分为3组：癌痛组(A1组)、癌痛+NS组(A2组)、癌痛+抑制剂组(A3组)，n=10。正常对照组(C组)随机分为2组：空白对照组(C1组)、空白+抑制剂组(C2)，n=10。A3组和C2组分别在建模后第13、14、21 d鞘内注射Akt抑制剂GSK690693 。A2组在建模后第13、14、21d鞘内注射等量生理盐水，A1组、B组、C1组均不给药处理。

1.3骨癌痛模型制作

参考Medhurst 等[3]文献中的方法，稍加改变，建立大鼠胫骨癌痛模型，用异氟烷气体厢式麻醉以后，改用鼻吸入维持，暴露左侧胫骨上段位置，取1 ml 注射器针头，在胫骨粗隆处，与骨面呈30°～40°角，钻孔，使用50 μl的微量注射器，抽取Walker 256 细胞悬液20 μl，细胞浓度为 1×108cells/μl，从穿刺针孔将悬液接种到骨髓腔内，拔出后迅速用医用骨水泥封住针孔，接下来用生理盐水局部冲洗，缝合伤口，创口处涂抹金霉素眼膏注射液预防感染。假手术组大鼠左侧胫骨的上段注入相同体积的生理盐水，余操作同癌痛模型组。C1 、C2不做任何处理。

1.4鞘内给药

根据 Mestre 等[4]描述的方法实施鞘内给药。A3组和C2组分别在建模后第13、14、21 d鞘内注射Akt抑制剂GSK690693，A2组在建模后第13、14、21 d鞘内注射等量生理盐水，A1组、B组、C1组均不给药处理。

1.5行为学测定

建模前、建模后第7、14、21天评估各组大鼠疼痛学行为：测大鼠左后足机械性缩足阈值和热缩腿潜伏期，统计分析大鼠的MWT、TWL。第14、21天鞘内注射抑制剂2h后测行为学并记录行为数据。

1.5.1大鼠左后足机械性缩足阈值测定将大鼠放在钢丝网格(1 cm×1 cm)上的有机玻璃盒(20 cm×20 cm×30 cm)中。用 Von Frey 纤维测量大鼠的机械缩足反射阈值。当大鼠左后足接触地面并正常负重时即可测量。从网格下刺激动物左后肢足底部中心皮肤，每根纤维弯曲至适当程度停留2～3 s，两次测量时间间隔10 s。von Frey 纤维的刺激强度顺序为由小到大。如果没有缩足反射，使用更大克数的纤维继续测量，测量最大值为26 g。取能引起50%缩足反应的最小克数值为机械缩足反射阈值。

1.5.2大鼠左后足热缩腿潜伏期参考并略加改进 Hargreaves 等的方法。将一个20 cm×20 cm×30 cm 有机玻璃罩放置在一块厚度为2 mm的玻璃板上，大鼠置于其中，玻璃下方是热痛刺激仪的红外光热探头。热刺激直接施加在双侧后足的足心部位。测量自动切断时间为 25 s，以免导致组织的实质性损伤。同一位点重复测量 5 次，测量每两次间隔至少10 min，不同位点测量每两次间隔5 min。测3次，取平均值作为热缩足反射阈值。

1.6免疫组织化学方法检测脊髓p-Akt水平

建模后第21天取大鼠脊髓L4-L6 段，采用免疫组化染色法观察脊髓中p-Akt的表达情况。具体方法：大鼠腹腔注射水合氯醛(10%) 300 mg/kg深度麻醉，沿着大鼠肋弓剖开胸腔，曝露心脏，经左心室升主动脉根部灌注 200 ml 生理盐水，冲洗净血管内血液，后改用 400 ml 固定液(含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲 液，pH 7.4，4 ℃)灌注1 h。迅速剥取大鼠腰段 L4～L6 节段脊髓，将L4～L6脊髓迅速放到4%多聚甲醛中固定,采用常规石蜡包埋,切片厚4 μm。脊髓切片进行常规脱蜡,然后加入3% H2O2孵育10 min,接着在枸橼酸缓冲液(pH=7.2)中煮沸10 min,血清封闭10 min后,移去多余的血清,加p-Akt 一抗(批号:KC-5A04,上海康成生物工程有限公司),在4 ℃条件下孵育15 h，15 h后依次加入二抗(批号:ZB-2010,北京中杉金桥生物技术有限公司)及SP,接着DAB 显色,苏木精复染,应用二甲苯透明,最后中性树胶封片。光镜下观察p-Akt 的阳性反应，并采像。

1.7Western blot法检测脊髓p-Akt水平

在实验开始的第21天，给大鼠腹腔注射水合氯醛(10%) 300 mg/kg深度麻醉后断颈处死。迅速剥离腰椎 L4-L6 节段对应的脊髓，在冰浴条件下将组织匀浆,提取总蛋白进行蛋白定量(BCA法)。10%SDS-PAGE 电泳,低压半干转膜3 h，进行免疫反应,接着加入p-Akt 一抗，4 ℃下孵育12 h，然后加入HRP标记的二抗(产品批号:ZB-2301,北京中杉金桥生物技术有限公司)，在室温下孵育2 h后,DAB 显色10 min后再采集图像。应用图像分析软件Image pro plus 6.0测定目标条带,以目标条带的积分光密度值(IOD) 作为p-Akt 的表达量，进行统计学分析。

1.8统计学方法

2结果

观察大鼠的MWT可以发现，C1、C2组表现相同，随时间推进机械缩足反射阈值轻度增大,变化幅度较小；B组术后MWT开始下降，第7天与C1组比较差异明显(P<0.05),第14天增高，至21天MWT数值与C1组接近(第21天，B组与C1组比较，P>0.05)。癌痛模型组(A1、 A2 、A3组)术后至第7天均呈现下降趋势，第14天，A1组、A2组、A3组分别与C1组比较，P<0.01。A3组与A1组比较，P<0.05，第21天，A3组MWT明显增高，接近C1组(P>0.05)，A1组MWT仍较低，与A3组比较，P<0.05，见表1。

表1　鞘内给予GSK690693对大鼠MWT的影响

注：第21天，A3组、B组、C2组分别与C1组比较，P均>0.05；A3组与A1组比较，P<0.05。

大鼠的TWL表现与MWT相似，癌痛模型组(A1、 A2 、A3组)术后至第7天均呈现下降趋势，B组术后MWT开始下降，第7天与C1组比较差异明显(P<0.05),之后逐渐增高，第14天，A1组、A2组、A3组分别与C1组比较，P<0.01。A3组与A1、A2组两两比较，P<0.05。第21天，A1组TWL较前缩短，A3组TWL明显延长，接近对照组C1水平，A3组与C1组比较P>0.05.A3组与A1组比较，P<0.05(表2)。

免疫组织化学结果表明，p-Akt 主要分布在脊髓中神经元的胞核内及细胞核周围的胞质中,A1组及A2组均有很强的阳性表达,A3组表达较弱。

Western blot半定量检测结果可见,与对照C1组数据比较，C1组与C2组p-Akt水平相当(P>0.05)，B组稍高(P>0.05)，A1组明显高于B组(P<0.05)；A2组P-Akt水平高于C1组(P<0.05)，鞘内注射GSK690693后，A3组p-Akt明显下降，低于A1及A2组(P<0.05)(图1)。

表2　鞘内给予GSK690693对大鼠TWL的影响

注：第21天，A3组、B组、C2组分别与C1组比较，P均>0.05.；A3组与A1组比较，P<0.05；A2组与A1组比较，P>0.05。

图1　p-Akt在大鼠脊髓中的免疫印迹半定量结果

3讨论

PI3K/Akt信号转导通路存在于机体内多种细胞中,参与细胞代谢、有丝分裂、细胞分化等多种生理过程。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidy linositol 3-kinase,PI3K)是生长因子受体超家族信号转导通路中的重要成员。PI3K在机体内各种细胞中普遍存在,可被多种理化因素激活及细胞因子激活。丝/苏氨酸激酶 (serine threonine kinase,Akt)位于PI3K信号通路的下游,主要负责 PI3K始动的信息传导,Akt位于此通路的中心环节,是PI3K的直接靶基因,激活的PI3K在质膜上产生第二信使PIP3，PIP3调节Akt的Ser473位点和Thr308位点的磷酸化，从而将Akt锁定于活化状态即为p-Akt[5-6]。GSK690693是Akt的特异性抑制剂,可抑制其信号向下游传导，降低下游的 p-Akt 水平,阻断p-Akt下游的信号级联反应，从而发挥生物学效应。

本研究中骨癌痛大鼠机械痛阈和热痛阈明显下降,体重减轻，胫骨影像学表现异常，胫骨病理切片可见骨质破坏，说明骨癌痛模型制备成功。大鼠的机械缩足反射阈值结果提示手术创伤影响大鼠MWT数值，诱导大鼠产生痛觉过敏，待创伤修复后，MWT数值逐渐升高，趋于正常，鞘内注射Akt抑制剂GSK690693后，MWT回升，提示GSK690693可以抑制PI3K/Akt

信号通路，抑制癌痛，降低机械痛觉过敏，改善疼痛。大鼠的热缩足反射潜伏期(TWL)结果显提示，手术创伤影响大鼠TWL数值，诱导大鼠产生热痛觉过敏，待创伤修复后,TWL数值逐渐升高，趋于正常；鞘内注射Akt抑制剂GSK690693后，TWL延长，热痛敏阈值升高，提示GSK690693可以降低大鼠热痛觉过敏，抑制PI3K/Akt信号通路，改善疼痛。鞘内注射GSK90693可以降低大鼠的痛域，但对大鼠骨质结构改变无明显影响，不能逆转大鼠骨质破坏。

本实验研究结果表明，乳腺癌骨转移疼痛模型大鼠脊髓p-Akt水平明显升高，提示在乳腺癌骨转移疼痛模型大鼠的疼痛发生过程中，PI3K/Akt信号通路发生激活，鞘内注射Akt抑制剂GSK690693后，脊髓中的p-Akt水平降低，PI3K/Akt信号通路受到抑制，大鼠疼痛症状好转，证实了PI3K/Akt信号通路在大鼠骨癌痛发生发展过程中起着重要作用，这为骨癌痛的治疗提供了新的方向，通过调控PI3K/Akt信号通路有望改善骨癌痛。有研究表明，PI3K/Akt信号通路可能通过激活下游NF-κB通路导致小胶质细胞的活化[7]，但具体的机制仍不明确。

综上所述，PI3K/Akt信号通路参与了乳腺癌骨转移大鼠骨癌痛脊髓水平的调节，但具体调节机制仍有待于进一步的研究证明。

参考文献

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[2]Vainio A，Auvinen A.Prevalence of symptoms among patients with advanced cancer：an international collaborative study.Symptom Prevalence Group〔J〕.J Pain Symptom Manage，1996，12(1)：3-10.

[3]Medhurst SJ，Walker K，Bowes M，et al.A rat model of bone cancer pain〔J〕.Pain，2002，96(1-2):129-140.

[4]Mestre C,Pelissier T,Fialip J,et al.(1994) A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats〔J〕.J Pharmacol Toxicol Methods,1994,32(4):197-200.

[5]李双双,许华.PI3K-Akt-mTOR信号转导通路与病理性疼痛的研究进展〔J〕.中国疼痛医学杂志,2014,20(3):173-176.

[6]Pearce LR，Komander D，Alessi DR.The nuts and bolts of AGC protein kinases〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2004，11(1)：9-22.

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(编辑：吴小红)

PI3K/Akt Signal Pathway in Cancer Pain Induced by Bone Metastases

YUANCuitang,DINGGang,LIAOZhijun,etal.

XinhuaHospitalAffliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai,200092

【Abstract】ObjectiveTo discuss the role of PI3K/Akt signal pathway in bone metastases pain caused by breast cancer in rats.MethodsWistar rats weighting 180～200 g were selected,all rats were randomly divided into 3 groups:group A was rat model of bone cancer pain,group B was sham operation group,group C was the control group.To establish bone cancer pain model,Walker 256 tumor cells was intra-left tibial inoculated in Wistar rats in group A.Group B was given normal saline of the same quantity,group C received no treatment.7 days after establishment of bone cancer pain model,the model were evaluated.The rats in group A that were successfully established bone cancer pain model were divided into 3 group:group A1 was rat model of bone cancer pain,group A2 was rat model of bone cancer pain+NS,group A3 was rat model of bone cancer pain+PI3K inhibitor.Rats in group C were divided into 2 groups:group C1 received no treatment,group C2 received PI3K inhibitor.On the 13th day,14th day,and 21st day,group A3 and C2 were injected by Akt inhibitor GSK690693.By intrathecal injection,group A2 was treated with NS in the same condition,there was no treatment on group A1,B,and C1.We measured mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency at 0,7,14,21 day.After 21 days when we finished behavior testing at 21 day,the lumbar segment 4～6 of spinal cord were isolated from these experimental rats.The level of p-Akt was detected by immunohistochemistry and western blots.ResultsIt was observed that MWT and TWL were reduced in each experimental group which indicated that the bone pain model was established successfully.The p-Akt level of spinal cord in bone cancer pain model was significantly higher than group C1 on the 21st day.Intrathecal injection of Akt inhibitors may suppress the expression of p-Akt in spinal cord.ConclusionThe PI3K/Akt signal pathway plays an important role in the initiation and development of bone cancer pain.

【Key words】PI3K/Akt;Spinal cord;Breast cancer cell

(收稿日期2015-09-09修回日期 2016-12-12)

中图分类号：R737.9

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2016)03-0349-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.001

通讯作者：陈思宇

基金项目：国家自然科学基金青年项目(81400905);上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院院级课题培育项目(P201410)