胰岛素样生长因子结合蛋白7过表达对人乳腺癌细胞系-7增殖的影响及其机制研究

魏丽瑶，岳春燕，彭健（中南大学湘雅医院普外科，湖南长沙410008）



胰岛素样生长因子结合蛋白7过表达对人乳腺癌细胞系-7增殖的影响及其机制研究

魏丽瑶，岳春燕，彭健
（中南大学湘雅医院普外科，湖南长沙410008）

摘要：目的探究过表达胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）对人乳腺癌细胞系-7（MCF-7）增殖的影响及其机制。方法采用LipofectamineTM2000将pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7质粒或pIRES2-ZsGreen1空白质粒转染进MCF-7乳腺癌细胞，并用荧光显微镜鉴定细胞转染；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）对转染48 h后IGFBP7蛋白进行定量；细胞凋亡实验检测转染24、48和72 h后各组细胞增殖情况；Western bolt检测转染48 h后各组细胞（蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白）（AKT/mTOR）信号通路相关蛋白的表达。结果Real-time PCR的检测结果提示经过IGFBP7转染的细胞IGFBP7 mRNA表达水平明显升高；细胞凋亡实验结果发现，与空白处理组和空白质粒转染组比较，IGFBP7过表达组细胞增殖能力明显降低；Western bolt检测结果发现，AKT蛋白的磷酸化水平明显下降，且其下游的mTOR表达明显下降（P<0.05）。结论IGFBP7过表达对MCF-7乳腺癌细胞的增殖具有抑制效果，可能是通过对AKT/mTOR信号通路的抑制达到对MCF-7的抑制。

关键词：实时荧光定量聚合酶链反应；胰岛素样生长因子结合蛋白7；增殖；蛋白激酶B

胰岛素样生长因子结合蛋白（insulin like growth factor binding proteins，IGFBPs），是一种对哺乳动物细胞中的胰岛素样生长因子（insulin like growth factors，IGFs）的生物利用度具有调节作用的蛋白质，因此在细胞的分化、增殖和生长等代谢过程中，IGFBPs具有极为重要的作用。目前研究发现，人体内有7种IGFBPs的亚型[1]。根据其对IGF的亲和力的不同将其分为低亲和力的IGFBP7～10和高亲和力的IGFBP1～6[2]。低亲和力的IGFBPs与IGFs的亲和力仅是高亲和力IGFBP的1/25～1/5。在低亲和力IGFBPs中最先被证实的是IGFBP7。

IGFBP7在人体中的分布较为广泛，诸如脾脏、大小肠以及卵巢等组织器官中均有表达，但研究[3]发现若组织发生肿瘤样变，其表达水平将发生下调甚至缺失，如在肝癌、前列腺癌以及乳腺癌等恶性肿瘤中；在正常的乳腺导管以及小叶上皮细胞中IGFBP7也有表达，在发生衰老的乳腺上皮细胞中则出现IGFBP7过表达现象[3]，乳腺癌组织中IGFBP7的表达却明显降低，并且与癌组织的恶性程度之间呈负相关[4]。由此可见，胰岛素样生长因子结合蛋白7能作为特异性标志物从病理学和血清学方面诊断乳腺肿瘤，同时IGFBP7有可能是一肿瘤抑制基因，可能成为肿瘤治疗的新靶点。因此，本实验通过在乳腺癌MCF-7细胞中过表达IGFBP7，研究IGFBP7的过表达对乳腺癌细胞增殖的影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7质粒、人乳腺癌细胞系-7（michigan cancer foundation-7，MCF-7）由本实验室保存，胎牛血清、达尔伯克必需基本培养基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）培养基购买于杭州四季青公司，胰酶、噻唑蓝、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购买于南京凯基生物公司，质粒提取试剂盒购买于美国Omega Bio-Tek公司，LipofectamineTM2000转染试剂购买于美国Invitrogen公司，兔抗人IGFBP7、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自美国Sigma公司，增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显色试剂盒来自南京凯基公司。

1.2仪器与设备

超净工作台购自苏州基团安泰空气技术公司，微量移液器购自德国Eppendorf公司，电热恒温干燥箱购自上海精宏实验设备公司，聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪购于德国Eppendorf公司，电子天平购自于德国精密仪器厂，恒温水浴锅购自海尔公司，凝胶成像系统购自美国Kodak公司。

1.3质粒抽提

采用Endo-Free Plasmid Mini KitⅡ进行质粒抽提：取摇菌后菌液离心收集，加入500μl SolutionⅠ重悬，加入500μl SolutionⅡ裂解，加入250μl冰浴Buffer N3中和生成白色沉淀，取上清液加入内毒素吸附缓冲液去内毒素，加入无水乙醇，离心吸附柱离心收集，加入500μl Buffer HB除蛋白质，700μl 2次DNA Wash Buffer脱盐，最后洗脱，酶标仪检测。

1.4MCF-7细胞培养

用10%的胎牛血清DMEM培养基，在37℃、5%二氧化碳CO2细胞培养箱中培养MCF-7乳腺癌细胞，待细胞增殖80%～90%时，用胰酶消化传代。

1.5细胞转染

在24孔板中接种MCF-7细胞，5×104个/孔，于第2天使用LipofectamineTM2000将pIRES2-Zs-Green1-IGFBP7质粒或pIRES2-ZsGreen1空白质粒转染进MCF-7乳腺癌细胞，分为空白对照组、空白质粒转染组和IGFBP7质粒转染组，置于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养6 h换液，继续培养24 h后，荧光显微镜观察转染率。

1.6对IGFBP7的mRNA表达水平进行测定

使用GAPDH作为PCR检测的内参指标，引物设计如下：IGFBP7正向引物5'-TGCCATGCATCCAATTCCCA-3'，反向引物5'-TGGAGGTTTATAGC TCGGCA-3'；GAPDH正向引物：5'-TGCACCACCAA CTGCTTAGC-3'，反向引物：5'-GGCATGGACTGTGG TCATGAG-3'。反应条件设定为：95℃预变性5 min，95℃变性30s，58℃退火30s，共42个循环，最后95℃继续延伸10 min。

1.7细胞凋亡实验

在96孔板中加入MCF-7细胞，过夜培养，3组细胞分别转染24、48和72 h后，再每孔中加入噻唑蓝20μl，继续4 h培养，再加入DMSO 150μl，应用自动酶标仪在570 nm处测定各组细胞的光密度（optical density，OD）值，对各组细胞的生存活力及增殖能力进行评估。

1.8Western blot检测蛋白表达

取40μg总蛋白于10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，用半干式电印迹将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后，分别加入相应一抗，4℃过夜，洗膜后分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1 h，洗膜后加ECL，将膜放入X线片暗盒、压片、显影、定影，以GAPDH的表达作为参照，比较目的条带的灰度值与内参条带的灰度值。

1.9统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，用单因素ANOVA统计法对数据进行分析，组间用最小显著性差异法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1表达载体的细胞转染

LipofectamineTM2000转染试剂转染48 h后，荧光显微镜观察转染情况，质粒转染成功，且转染率> 70%。见图1。

2.2转染后MCF-7细胞中IGFBP7mRNA的表达

转染48 h后，RT-PCR检测各组细胞的IGFBP7 mRNA水平，空白处理组和空白质粒转染组比较，差异无统计学意义（P=0.121），IGFBP7组细胞与空白处理组比较，差异有统计学意义（P =0.012），且IGFBP7 mRNA水平升高。IGFBP7组细胞和空白质粒转染组比较，差异有统计学意义（P=0.003），IGFBP7 mRNA水平升高。见图2。

2.3MCF-7细胞的增殖能力

噻唑蓝细胞活力检测结果显示，空白质粒转染组与空白处理组细胞活力比较，差异无统计学意义（P=0.312），空白质粒转染组略升高3%（见图3）。IGFBP7组细胞活力与空白处理组比较，差异有统计学意义（P=0.005），低于空白处理组；与空白质粒转染组比较，差异有统计学意义（P=0.001），低于空白质粒转染组，其中72 h最为明显（见图4），IGFBP7可抑制MCF-7细胞增殖。

2.4IGFBP7过表达对MCF-7细胞中蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路的影响

Western blot检测过表达转染IGFBP7的MCF-7细胞中在蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的蛋白表达，结果显示3组在AKT的蛋白表达方面差异无统计学意义，但AKT蛋白磷酸化状态，IGFBP7组减弱，同时下游的mTOR蛋白表达也减弱。见图5。3）

图1　质粒转染细胞48 h荧光效果图

图2　转染后48 h后各组细胞IGFBP7 mRNA的表达

图3　各组MCF-7细胞增殖比较

图4　24、48和72 h各组MCF-7细胞增殖情况比较

图5　IGFBP7对MCF-7细胞中AKT/mTOR信号通路的影响

3　讨论

胰岛素样生长因子结合蛋白7作为IGFBP超家族中的一员，在细胞的分化、增殖和生长等代谢过程中具有极为重要的作用。其中大量的研究证实IGFBP7的表达与多种癌症的发生相关[5-9]，是多种肿瘤的抑癌因子。

乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一，其病死率高居女性癌症首位，而在我国，乳腺癌的发病率不仅逐年上升，而且日趋年轻化。虽然目前对于乳腺癌的治疗取得了一定的进展，但乳腺癌的发病率的增长速度仍不容乐观。

IGFBP7可抑制多种肿瘤细胞的增殖，但其生物分子机制不尽相同。近年来研究表明，AKT/mTOR通路在肿瘤细胞增殖、血管新生和转移以及对放化疗的拮抗起重要作用，其在乳腺癌中经常被激活，乳腺癌中这条信号通路的活化高达70%。目前的研究结果显示，AKT/mTOR信号通路的被激活可能是导致恶性肿瘤发生的一个重要原因，其主要是对细胞的周期产生影响从而对细胞的增殖发生改变。AKT/ mTOR信号通路的活化与肿瘤细胞的发展有着密切的相关性[10]。也有研究指出AKT以及下游的mTOR，将肿瘤细胞的增殖起到抑制作用[11]。本次研究中，通过过表达IGFBP7，对AKT/mTOR信号通路进行抑制，达到抑制细胞活力和增殖的目的。

本研究中IGFBP7在MCF-7乳腺癌细胞中出现过表达，对转染细胞株的增殖和活力水平进行检测发现，转染组细胞的活力和增殖能力明显下降，同时伴随着IGFBP7的过表达，MCF-7乳腺癌细胞中的AKT/mTOR信号通路被抑制，IGFBP7的过表达与MCF-7乳腺癌细胞之间呈现负相关。

参考文献：

[1] Baxter RC.IG F binding proteins in cancer:mechanistic and clinical insights[J].Nat Rev Cancer,2014,14(5):329-341.

[2] Kim HS,Nagalla SR,Oh Y.Identification of a family of low-affinity insulin-like growth factor binding proteins (IGFBPs):characterization of connective tissue growth factor as a member of the IGFBP super family[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(24):12981-12986.

[3] Burger AM,Leyland-Jones B,Banerjee K.Essential roles of IGFBP-3 and IGFBP-rPI in breast cancer[J].Eur J Cancer,2005,41(11):1515-1527.

[4] Ivan B,Florence L,Sengul T.Molecular profiling of inflammatory breast cancer:identifi-cation of a poor-prognosis gene expression signature[J].Clin Cancer Res,2004,10(20):6789-6795.

[5] Chen QJ,Zhou HM,Chen J,et al.Using a modified TA cloning method to crease entry clones[J].Anal Biochem,2006,359:120-125.

[6] Yen TY,Li KP,Ou SC.Construction of an infectious plasmid clone of muscovy duck parvovirus by TA cloning and creation of a partially attenuated strain[J].Avian Pathol,2015,44(2):124-128.

[7] Benatar T,Yang W,Amemiya Y,et al.IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathway[J].Breast Cancer Res Treat,2012,133(2):563-573.

[8] Suzuki H,Igarashi S,Nojima M,et al.IGFBP7 is a p53-responsive gene specifically silenced in colorectal cancer with CpG island methlator phenotype[J].Carcinogenesis,2010,31(3):342-349.

[9] Vizioli MG,Sensi M,Miranda C,et al.IGFB7:an onco-suppressor gene in thyroid carcinogenesis[J].Oncogene,2010,29(26):3835-3844.

[10] Kim EY,Kim A,Kim SK,et al.Inhibition of mTORC1 induces loss of E-cadherin through AKT/GSK-3β signaling-mediated up-regulation of E-cadherin repressor complexes in non-small cell lung cancer cells[J].Respir Res,2014,15:26.

[11] Li X,Yang Q,Yu H,et al.LIF promotes tumorigenesis and metastasis of breast cancer through the AKT-mTOR pathway[J].Oncotarget,2014,5(3):788-801.

（申海菊编辑）

Effect of IGFBP7 overexpression on proliferation of breast cancer cell line MCF-7

Li-yao Wei,Chun-yan Yue,Jian Peng
(Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

Abstract:Objective To investigate the effect of insulin-like growth factor binding protein 7(IGFBP7) on proliferation of human breast cancer cell line MCF-7 and its mechanism.Methods Plasmid pIRES2-ZsGreen1-IGFBP7 or empty plasmid pIRES2-ZsGreen1 was transfected into MCF-7 cells using LipofectamineTM2000 and the cell transfection efficiency was examined by fluorescence microscopy.Real-time fluorescent quantitative PCR (RTFQPCR) was used to quantify the expression of IGFBP7.MTT was performed to evaluate the effect of IGFBP7 on proliferation and apoptosis of MCF-7 cells at 24,48 and 72 hours after transfection.The expression of relevant proteins of AKT/mTOR signaling pathway was analyzed by Western blot.Results The IGFBP7 mRNA level increased significantly after IGFBP7 transfection.Compared with the controls,cell proliferation noticeably decreased in the IGFBP7-transfected group.Western bolt analysis indicated that the AKT phosphorylation was down-regulated,and the mTOR level dropped markedly (P < 0.05).Conclusions Overexpression of IGFBP7 could down-regulate the proliferation of MCF-7 cells,possibly via inhibiting the AKT/mTOR signaling pathway.

Keywords:real-time quantitative polymerase chain reaction; insulin-like growth factor binding protein 7; proliferation; protein kinase B

[通信作者]彭健，E-mail：970266784@qq.com；Tel：13607441906

收稿日期：2015-12-02

文章编号：1005-8982（2016）06-0015-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.004

中图分类号：R737.9

文献标识码：A