microRNA-10b及靶基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及侵袭能力的影响*

熊建宁，胡立春，王亚兵，段雪飞（广东省佛山市南海区第三人民医院肝胆外科，广东佛山528244）



microRNA-10b及靶基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及侵袭能力的影响*

熊建宁，胡立春，王亚兵，段雪飞
（广东省佛山市南海区第三人民医院肝胆外科，广东佛山528244）

摘要：目的探讨microRNA-10b（miR-10b）及其靶基因同源异性盒基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及转染miR-10b对肝癌细胞侵袭性能力的影响。方法分析HOXD10基因在3种肝癌细胞株Huh7、HepG2、SMMC-7721中的基础表达量，筛选出HOXD10基础表达量高的HepG2作为后续研究对象。设计合成外源性miR-10b序列，用脂质体瞬时转染肝癌细胞株，设置miR-10b转染组、无关序列转染组（阴性对照组）和未处理组（对照组）。用RT-PCR及Western blot检测肝癌细胞转染miR-10b后HOXD10基因及蛋白表达量的变化，细胞侵袭实验研究转染miR-10b对肝癌细胞侵袭能力。结果在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表达量2-ΔΔCT分别是（1.24±0.23）、（1.00±0.02），P>0.05差异无统计学意义。在蛋白分析HepG2细胞灰度计算值是值分别是653.492和1 968.742，蛋白水平表达降低。HOXD10基因在肝癌细胞株HepG2的表达量显著高于Huh7和SMMC-7721；miR-10b成功转染HepG2后，HOXD10基因表达水平与对照组比较无明显变化，但HOXD10蛋白表达量与对照组比较下降及侵袭性也增强。结论miR-10b可能通过抑制靶基因HOXD10表达发挥作用，促进肝癌细胞的侵袭。

关键词：肝癌细胞；microRNA-10b；HOXD10；侵袭

研究发现肿瘤发生、发展与microRNA的关系越来越密切。microRNA-10b（miR-10b）在乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤等肿瘤组织中均有异常表达，并且与肿瘤的侵袭性和远处转移密切相关[1]。HOXD10 （HomeoboxD10）被认为可能是miR-10b的靶基因，属于同源异型盒基因家族中的一员，位于2号染色体，是细胞分化、个体发育生长的关键基因位点。目前HOXD10基因与肿瘤发生、发展的关系研究，主要集中在乳腺癌、血液病、食道癌、胶质瘤等方面，与肝癌相关的研究较少[2]。本研究拟通过设计合成外源性miR-10b转染肝癌细胞株，转染成功后，验证HOXD10基因及蛋白表达量的变化，探讨转染miR-10b对肝癌细胞侵袭能力的影响。

1　材料与方法

1.1材料和试剂

肝癌细胞株HepG2由广东省医学科学院医学研究所细胞中心保存。RPMI 1640、DMEM培养基和胎牛血清（Hyclone公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），转染试剂Lipofectamine 2000（Invtrigen公司），一抗1∶1 000，二抗1∶5 000（美国Southern Biotech公司），体外侵袭实验装置（美国BD公司），Transwell侵袭小室（美国Millipore公司）。

1.2生物信息学分析

TargetScan[http://www.targetscan.org/],picTar[http://pictar.org/],miRanda[http://www.microrna.org/microrna/]3种生物学软件分析miR-10b可能调控的靶基因，选取HOXD10为目的基因。引物及miR-10b序列由广州锐博生物科技有限公司合成。

1.3试验方法

肝癌细胞用DMEM、RPMI 1640完全培养基传代培养，收集对数生长期的细胞进行实验。细胞瞬时转染，选择HepG2细胞脂质体转染miR-10b mimics24h用QPCR检测。PCR分析mRNA表达量，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法克隆非翻译区（3'-UTR）引物序列为：HOXD10-正向引物：5'-CCGAAGTGCAGGAGAAGGAA；HOXD10-负向引物：5'-GTGTAAGGGCACCTCTTCTTTCTG，测序正确后常规方法转染HepG2细胞，同时在细胞内检测HOXD10表达量。Western blot分析：用BCA法。体外细胞侵袭实验：细胞转染miR-10b后HepG2接种至侵袭装置，培养24 h后经吉姆萨染色对穿膜细胞计数。

1.4统计学方法

所有实验数据用SPSS 13.0统计软件包进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行正态性分析及独立样本t-test，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HOXD10在3种肝癌细胞中表达及构建高表达miR-10b

Huh-7细胞，HepG2细胞，SMMC-7721细胞HOXD10基因经PCR比较基础表达量2-ΔΔCT分别是1.00、228.71和1.55，见表1、图1。蛋白分析HepG2细胞灰度计算值是930.22，Huh-7是406.00，SMMC-7721是249.00，见图2。通过基因和蛋白实验结果筛选出表达量高的HepG2细胞符合下一步实验要求。miR-10b逆转录后表达量为（9 772.22± 437.99），与阴性对照组比较，P<0.05，差异有统计学意义，说明构建高表达miR-10b成功，见表2、图3。

表1　HOXD10基因在3种肝癌细胞相对表达量（±s）

表1　HOXD10基因在3种肝癌细胞相对表达量（±s）

组别Huh7 HepG2 SMMC-7721基础表达量2-ΔΔCT1.00±0.00 228.71±0.12 1.55±0.01

图1　HOXD10在肝癌Huh7、HepG2以及SMMC-7721细胞表达量比较

图2　HOXD10在肝癌Huh7、HepG2以及SMMC-7721细胞蛋白表达

2.2转染后HOXD10在肝癌细胞中基因及蛋白表达

HepG2肝癌细胞中转染miR-10b的HOXD10实验组与阴性对照组，在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表达量2-ΔΔCT分别是（1.24±0.23）和（1.00±0.02），P>0.05差异无统计学意义。见表3、图4。在蛋白分析HepG2细胞灰度计算值分别是1 968.742和653.492，蛋白水平表达降低，见图5。

2.3体外细胞侵袭实验

体外细胞侵袭实验穿膜细胞计数结果显示：HepG2转染miR-10b过表达后（112.38±11.27），与阴性对照组（75.25±6.35）比较细胞侵袭能力增加（P<0.05）。见表4。

表2　转染MiR-10b基因在3种样品中相对表达量（±s）

表2　转染MiR-10b基因在3种样品中相对表达量（±s）

注：NC：过表达miR-10b的阴性对照组；miR-10b组：过表达miR-10b组；miR-10b组与NC组比较，t=-35.705，P=0.000

未处理组NC组组别miR-10b组基础表达量2-ΔΔCT9 772.22±437.99 0 1.21±0.01

图3　miR-10b在3种样品中的表达水平

表3　转染后肝癌细胞株HOXD10基因相对表达量（±s）

表3　转染后肝癌细胞株HOXD10基因相对表达量（±s）

注：NC：过表达miR-10b的阴性对照组；miR-10b组：过表达miR-10b组；miR-10b组与NC组比较，t=6.245，P=0.220

组别miR-10b组基础表达量2-ΔΔCT1.24±0.23未处理组NC组1.47±0.22 1.00±0.12

图4　miR-10b在转染后HOXD10表达

图5　Western blot分析转染后蛋白表达

表4　细胞侵袭实验穿膜细胞计数（±s）

表4　细胞侵袭实验穿膜细胞计数（±s）

注：未处理组：HepG2；NC：过表达miR-10b的阴性对照组；miR-10b组：过表达miR-10b组；F=6.726，P=0.006组间差异有统计学意义，miR-10b组与NC组比较，P=0.043

NC组miR-10b组75.25±6.35 112.38±11.27组别未处理组细胞计数79.38±4.16

3　讨论

miRNA在转录后基因表达和生物行为发展过程起着重要调控作用，大多数人类癌症与miRNA发挥抑癌基因或癌基因作用有关[3]。肿瘤发生在染色体易变位点上，即染色体上易发生丢失、移位或重复的部位，是微小RNA表达异常与某些肿瘤关系密切的原因[4]。肝细胞癌中2号染色体短臂发生突变，而miR-10b恰位于该突变部位。Ma等[5]发现miR-10b高表达和肿瘤细胞的血管侵袭相关；特异性增加miR-10b表达量可促进肿瘤细胞的侵袭。Laderio等[6]报道109例肝脏样本肝细胞癌29例、肝良性病变局灶性结节性增生5例，癌旁组织93例，其中miR-10b表达量显著高于良性病变和未发生肿瘤病变的肝脏组织，同时把miR-10b看做肝脏肿瘤细胞侵袭性、转移的相关因素；说明在肝癌组织中miR-10b表达上调，可抑制某些靶基因表达而发挥癌基因作用。HOXD10基因同样位于2号染色体，是细胞分化、个体发育生长的关键基因位点[7]。受到miR-10b及其他多种负性调控作用，HOXD10在多数恶性肿瘤表达缺失，从而增强肿瘤细胞的侵袭能力[8]。Myers等[9]研究表明持续表达的HOXD10基因，对乳腺肿瘤细胞新生血管的生成起到一定的抑制作用。Carrio等[10]在HOXD10抑制脑胶质瘤细胞的侵袭和转移研究中同样发现，高表达HOXD10可以抑制新生毛细血管形成，从而抑制正常脑细胞向肿瘤细胞分化，因此，HOXD10被认为是抑癌基因。上调miR-10b可以抑制mRNA编码HOXD10翻译过程，导致增加有潜在转移性质的基因RHoC，并且发现随着进展期乳腺癌肿瘤侵袭程度增加，HOXD10表达却逐渐消失[11]。HOXD10过表达可以抑制RHoC蛋白的表达，进而可以阻止miR-10b诱导的肿瘤细胞发生侵袭转移[12]。Liao等[13]试验60例不同肝细胞肝癌TNM分期中miR-10b表达情况与肝癌细胞转移能力相关，得出miR-10b负调控HOXD10在转录后水平通过HOXD10相关基因RhoC/uPAR/MMPs促进肝癌细胞转移和侵袭。

总结分析得出实验采用微小RNA瞬时转染方法，可以提高miR-10b基因在转染细胞HepG2细胞中的表达量，在靶基因基础表达量高的前提下，通过RT-PCR和Western blot方法研究在肝癌细胞中HOXD10基因和蛋白的表达情况，结果发现HOXD10在mRNA水平变化小而蛋白水平表达是降低的，说明miR-10b是通过转录后翻译阶段来调节靶基因的表达，该靶基因可能起到抑制癌基因作用，过表达miR-10b增加了HepG2细胞侵袭能力。miR-10b过表达与肝细胞癌的侵袭关系密切，为进一步研究肝癌细胞的多种生物学特征提供实验依据。

参考文献：

[1] Du J,Wang Y,Fu H,et al.Clinical and pathological features of miR-10b and RHOC gene expression in hepatocellular carcinoma[J].Chinese Science Bulletin,2014(19):2249-2253.

[2] Nakayama I,Shibazaki M,Yashima-Abo A,et al.Loss of HOXD10 expression induced by upregulation of miR-10b accelerates the m igration an d invasion activities of ovarian cancer cells[J].Int J Oncol,2013,43(1):63-71.

[3] Iorio MV,Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation[J].Cancer J,2012,18(3):215-222.

[4] Calin GA.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].Proc.Nacad Sci USA,2004,101(2004):2999-3004.

[5] Ma L,Teruya-Feldstein J,Weinberg RA.Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J].2007,449(7163):682-688.

[6] Ladeiro Y,Couchy G,Balabaud C,et al.MicroRNA profiling in hepatocellular tumors is associated with clinical features and oncogene/tumor suppressor gene mutations[J].Hepatology,2008,47(6):1955-1963.

[7] Tian Y,Luo A,Cai Y,et al.MicroRNA-10b promotes migration and invasion through KLF4 in human esophageal cancer cell lines[J].J Biol Chem,2010,285(11):7986-7994.

[8] Lund AH.miR-10 in development and cancer[J].Cell Death Differ,2010,17(2):209-214.

[9] Myers C,Charboneau A,Cheung I,et al.Sustained expression of homeobox D10 inhibits angiogenesis[J].Am J Pathol,2002,161 (6):2099-2109.

[10] Carrio M,Arderiu G,Myers C,et al.Homeobox D10 induces phenotypic reversion of breast tumor cells in a three-dimensional culture model[J].Cancer Res,2005,65(16):7177-7185.

[11] Baffa R,Fassan M,Volinia S,et al.MicroRNA expression profiling of human metastatic cancers identifies cancer gene targets[J].J Pathol,2009,219(2):214-221.

[12] Steeg Sa GS.Cancer:micromamagement of metastasis[J].Nature,2007,7163(499):671-673.

[13] Liao CG,Kong LM,Zhou P,et al.miR-10b is overexpressed in hepatocellular carcinoma and promotes cell proliferation,migration and invasion through RhoC,uPAR and MMPs[J].J Transl Med,2014,12:234.

（张蕾编辑）

Expression of miR-10b and target gene HOXD10 in liver cancer cell lines and its impact on tumor invasion*

Jian-ning Xiong,Li-chun Hu,Ya-bing Wang,Xue-fei Duan
(Department of Hepatobiliary Surgery,the Third People's Hospital of Nanhai,Foshan,Guangdong 528244,China)

Abstract:Objective To investigate the expression of miR-10b and its targeted gene HOXD10 in hepatic carcinoma cell lines and its influence on tumor invasion.Methods Basic expression of HOXD10 gene in the three hepatic carcinoma cell lines (Huh7,HepG2 and SMMC-7721) was determined.Mature mimics of miR-10b were chemically synthesized and transiently transfected into higher HOXD10-expression cell line HepG2 cells via lipofectamine 2000.Cells were also transfected with empty vectors and unrelated fragment to serve as negative controls.The invasion of HepG2 cells was investigated by Transwell assay.The expressions of HOXD10 were detected by RT-PCR and Western blot.Results The expression levels of gene and protein at 2-Δ Δ CTwere (1.24±0.23) and (1.00±0.02) without significant difference (P > 0.05).In protein analysis of HepG2 cells,gray value was calculated to be 653.492 and 1968.742 respectively,and protein expression levels were reduced.Target gene HOXD10 was over-expressed in HepG2 cells and the ability of tumor invasion increased.Conclusions Synthesized miRNA-10b can regulate the expression of target gene HOXD10 and promote the invasion of the hepatic carcinoma cells.

Keywords:hepatic carcinoma cell; miRNA-10b; HOXD10; invasion

[通信作者]胡立春，E-Mmail：spring@126.com，Tel：13702984975

*基金项目：广东省佛山市卫生和计划局医学科研课题（No：2015343）

收稿日期：2015-10-25

文章编号：1005-8982（2016）06-0011-04

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.06.003

中图分类号：R735.7

文献标识码：A