基于Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极的电化学发光分析法测定脯氨酸

高红方，王玉凤，漆红兰

（陕西省生命分析化学重点实验室，陕西师范大学化学化工学院，陕西西安710062）

基于Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极的电化学发光分析法测定脯氨酸

高红方，王玉凤，漆红兰*

（陕西省生命分析化学重点实验室，陕西师范大学化学化工学院，陕西西安710062）

利用滴涂法和静电吸附作用制备了Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion修饰的玻碳电极，基于脯氨酸对Ru(bpy)32+电化学发光的信号增强作用，建立了测定脯氨酸的电化学发光分析新方法。实验结果表明，在pH9.5的碳酸盐介质中，电化学发光强度与脯氨酸浓度在2.0×10－10～1.0×10－8mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为3.7×10－11mol/L(S/N=3)。

电化学发光；脯氨酸；Ru(bpy)32+；修饰电极

0 引言

脯氨酸 (proline，Pro)是一种氨基酸类药物，研究表明人体体液中Pro含量变化与多种疾病如骨病[1]、癌症[2－3]、慢性尿毒症[4]等有关。建立灵敏、快速检测脯氨酸的分析方法具有重要意义。文献报道的测定Pro的方法有质谱法[5]、液相色谱法[6]、化学发光法[7]等。这些方法有些操作复杂，有些灵敏度不高。电化学发光分析方法具有操作简单，灵敏度高，检测速度快等优点[8]。在前期工作[9]的基础上，以玻碳电极作为基底电极，利用滴涂法和静电吸附作用制备了Ru(bpy)32+/ AuNPs/Nafion/GCE修饰电极。基于Pro对Ru(bpy)32+电化学发光行为的增强作用，建立简单、灵敏的检测脯氨酸的电化学发光分析方法。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

氯化三(2,2'－联吡啶)钌(II)六水合物（Ru(bpy)3Cl2，Ru(bpy)32+）、Nafion（perfluoinated ionexchange resin）和脯氨酸 （Pro）均购自Sigma-Aldrich；氯金酸、柠檬酸钠、铁氰化钾、碳酸钠、碳酸氢钠和氯化钾均购自国药集团化学试剂有限公司。 实验所用溶液均用Millipore Milli Q water (＜18 M/cm)水配制。

CHI 600B电化学工作站 （上海辰华仪器公司，上海，中国）；发光测量系统为MPI－E型电致化学发光分析系统(西安迈瑞分析仪器有限公司,中国)，超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）。三电极系统包括玻碳电极（Φ=2 mm）或者修饰电极为工作电极，铂片电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极。

1.2 修饰电极的制备和电化学发光测量脯氨酸

Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极制备参考文献[9]。在1 mL含不同浓度脯氨酸的0.1 mol/L碳酸盐缓冲溶液(pH=9.5)中，利用线性单扫描伏安法，以扫描速率0.05 V/s在0~1.4 V电位范围内扫描，记录电化学发光-电位曲线；或者利用阶跃脉冲技术，初始电压为0 V，最高电压为1.10 V，脉冲时间为30 s，记录电化学发光-时间曲线。 光电倍增管（PMT）负高压设置为600 V。以电化学发光强度为分析信号，进行脯氨酸的检测。

2 结果与讨论

2.1 Pro增强Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极的电化学发光行为

根据文献[9]，利用滴涂法和静电吸附作用制备了Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion修饰的玻碳电极。制备的金纳米粒子的透射电镜图如图1所示。从电镜可以观察到，金纳米粒子表面光滑，分布均匀，粒径在12 nm左右。

图1 金纳米粒子的电镜图Fig.1 TEM image of AuNPs

图2为Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极在含有 8.0×10-10mol/L Pro的0.1 mol/L碳酸盐缓冲液中的电化学发光-电位曲线图。从图2可以看出，在没有Pro的缓冲溶液中，Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极在 1.1 V左右产生弱的电化学发光信号（1241）；加入8.0×10-10mol/L Pro后，在1.1 V处的电化学发光强度增加到4263。说明 Pro在碱性介质中能够增强Ru(bpy)32+的电化学发光，可用于测定Pro。

图2 Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极在0.1 mol/L碳酸盐缓冲液（pH=9.5）溶液(a)和含8.0×10-10mol/L Pro的0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(pH=9.5)中的电化学发光-电位曲线图(b)Fig.2 ECL intensity-potential profiles obtained at Ru (bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE electrode in 0.1 mol/L carbonate buffer(pH9.5)(a)and 0.1 mol/L carbonate buffer (pH9.5)containing 8.0×10-10mol/L Pro

2.2 条件优化

实验中首先考察电位和溶液pH对电化学发光强度的影响，结果如图3和4所示。从图3可以看出，在1.0 V～1.1V之间增加施加电压，电化学发光信号随之增强；当电压大于1.1 V后，电化学发光强度趋于平稳，实验选择施加电位为1.1 V。

图3 施加电压对电化学发光强度的影响曲线Fig.3 The dependence of ECL intensity of Ru(bpy)32+/ AuNPs/Nafion/GCE on applied potential for the detection of 5×10-9mol/L Pro

图4 pH对电化学发光强度的影响曲线Fig.4 The dependence of ECL intensity of Ru(bpy)32+/ AuNPs/Nafion/GCE on pH.I0is the ECL peak in the absence of Pro(a),ISis the ECL peak in the presence of 1×10-9mol/L Pro(b),(c)ΔI=IS-I0

根据相关文献的报道[10]，缓冲溶液的pH对电化学发光检测过程有着重要影响。为获得最佳检测效果，该研究也对pH进行优化。在pH6.9~ pH10.1范围内，在选定的电位下，考察介质pH对5×10-9mol/L脯氨酸-Ru(bpy)32+电化学发光强度的影响。实验结果如图4所示。结果表明，在pH6.9~pH9.4范围内脯氨酸-Ru(bpy)32+的电化学发光强度随pH增大而增大，在pH9.4~pH10.1范围内脯氨酸Ru(bpy)32+的电化学发光强度基本不随pH的变化而变化。因此，实验选择pH=9.5的0.1 mol/L碳酸盐缓冲液为测定的缓冲条件。

2.3 工作曲线与检出限

在优化的实验条件下，采用阶跃脉冲技术对脯氨酸进行测定。图5为修饰电极在不同浓度Pro中的电化学发光-时间曲线。从图5可以看出，随着加入Pro浓度的增加，修饰电极的电化学发光强度随之增加；电化学发光强度的变化值ΔI与脯氨酸的浓度在2.0×10-10~1.0×10-8mol/L范围内呈现良好的线性关系（如图5内插图）。线性回归方程为ΔI=1247c+2779（c的单位为nmol/L，相关系数r=0.9939）。脯氨酸的检出限为3.7×10-11mol/L(S/N=3)。该Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极可以通过电化学发光强度的变化实现对脯氨酸的灵敏检测。

图5 Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极在不同浓度Pro中的电化学发光-时间曲线内插图：脯氨酸的校准曲线Fig.5 ECL intensity vs time profiles of the Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE for different concentrations of Pro.Insert, the calibration curve of Pro.Concentrations of Pro:2.0×10-10mol/L(a),5.0×10-10mol/L(b),1.0×10-9mol/L(c), 2.0×10-9mol/L(d),5.0×10-9mol/L(e),7.0×10-9mol/L(f),9.0×10-9mol/L(g)and 1.0×10-8mol/L(h)

3 结论

基于脯氨酸对Ru(bpy)32+电化学发光强度的增强作用，利用Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE修饰电极，建立了一种高灵敏检测脯氨酸的电化学发光分析新方法。实验结果表明，该方法测定脯氨酸具有较高的灵敏度和较低的检出限。

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Electrogenerated chemiluminescence determination of proline using Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion modified electrode

Gao Hong-fang,Wang Yu-feng,Qi Hong-lan*
(School of Chemistry and Chemical Engineering,Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China)

The Ru(bpy)32+/AuNPs/Nafion/GCE modified electrode was fabricated and applied to detect proline by electrogenerated chemiluminescence (ECL)method.A sensitive ECL method was developed for determination of proline in the linear range of 2.0×10－10～1.0×10－8mol/L in pH9.5 carbonate buffer solution.The detection limit was 3.7×10－11mol/L.

ECL;proline;Ru(bpy)32+;modified electrode

国家自然科学基金资助（No 21375084）

*通信联系人,E－mail:honglanqi＠snnu.edu.cn