基于PtNFs-GOD复合材料的电致化学发光葡萄糖生物传感器的研究

廖 妮

(攀枝花学院生物与化学工程学院,四川攀枝花617000)

基于PtNFs-GOD复合材料的电致化学发光葡萄糖生物传感器的研究

廖 妮*

(攀枝花学院生物与化学工程学院,四川攀枝花617000)

采用一锅合成法制备了新型的具有大比表面积的花状铂纳米颗粒（PtNFs），将制备好的花状铂纳米颗粒与聚乙烯醇缩丁醛（PVB）的乙醇溶液混合，用溶胶-凝胶法使葡萄糖氧化酶（GOD）固定于玻碳电极上，构建了一个高灵敏电致化学发光（ECL）生物传感器用于检测葡萄糖。基于PtNFs-GOD修饰的葡萄糖生物传感器显示出了良好的性能，其检测线性范围为1.00×10-5~3.00×10-4mol/L,检测下限为0.33×10-6mol/L。该生物传感器重现性、选择性与稳定性好、使用寿命较长，回收率在96.81%~100.98%之间，可应用于实际样品葡萄糖含量的检测。

花状铂纳米颗粒；电致化学发光生物传感器；葡萄糖

0 引言

葡萄糖是生命活动中不可缺少的碳水化合物，也是人体新陈代谢的重要营养物质。许多的慢性疾病比如心血管疾病、高血糖、肥胖症、糖尿病都与葡萄糖密切相关。因此，葡萄糖含量检测对于评估人体健康状况具有非常重要的意义！目前，测定葡萄糖的方法主要有分光光度法[1]、高效液相色谱法[2]、毛细管电泳法[3]等，然而这些方法操作复杂、分析速度慢、成本较高，且在检测范围和灵敏度方面很难达到低浓度检出限。因此，发展能够快速、简便、灵敏地检测低浓度葡萄糖的方法，具有十分重要的现实意义。

电致化学发光（ECL）是近些年发展起来的一种新型分析方法[4]。由于其简单、快速、灵敏,可控及低背景等特点，该方法被广泛地应用于各个领域，如环境污染物监测，药物分析及人体相关生物分子的检测等[5-6]。S2O82--O2体系的ECL发光现象由于其经济、简单的优点，该ECL体系被逐渐受到越来越多的关注[7]。

葡萄糖氧化酶对葡萄糖具有高的选择性和灵敏度，常被用于制备各种生物传感器，以满足葡萄糖检测的需要。研究表明，葡萄糖氧化酶（GOD）和辣根过氧化物酶（HRP）可以协同催化底物中的葡萄糖水解并产生O2，进而实现S2O82--O2ECL体系信号的放大及稳定性的提高。近年来，葡萄糖传感器由于灵敏度高、稳定性好、操作简单等优点已成为生化分析和临床检验等方面的一个重要研究方向。

在该工作中，该文课题组提出一种仿双酶协同催化原位产生共反应试剂的策略，并成功将其应用于S2O82--O2ECL体系，实现了信号的放大及稳定性的提高。因此，在该文中该文课题组制备了具有大比表面积的花状铂纳米颗粒，铂纳米颗粒具有模拟辣根过氧化物酶（HRP）的作用，并且与GOD酶性质相结合，论证仿双酶标记可以大大增强过硫酸根体系的ECL信号。利用GOD和PtNFs同时作为标记物，通过GOD的催化作用产生H2O2，接着被PtNFs催化原位产生高浓度的O2，从而克服了上述缺陷，从而实现葡萄糖的超灵敏检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

MPI-E型电致化学发光分析系统(西安瑞迈分析仪器有限公司、中科院长春应化所)；扫描电子显微镜(S-4800，日本Hitachi Instrument公司)。实验采用的三电极体系，修饰过的玻碳电极(GCE，Φ=4 mm)为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。

过硫酸钾（K2S2O8）购于上海康达氨基酸厂；氯铂酸(H2PtCl6)购于Sigma公司；葡萄糖氧化酶（GOD）购于上海生化有限公司；磷酸缓冲溶液（PBS，0.1 mol/L，pH7.4）是用0.1 mol/L KH2PO4，0.1 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L KCl混合配制而成；其他试剂均为分析纯试剂，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 花状铂纳米颗粒（PtNFs）的制备

花状铂纳米颗粒（PtNFs）的制备是采用一锅合成法制得的。步骤如下：首先称取0.0421 g多巴胺（DA）作为还原剂，溶于10 mL水中形成混合均匀的溶液。向上述溶液中加入20 μL 0.5% Nafion溶液和1 mL 1%H2PtCl6溶液。持续搅拌一个小时使得H2PtCl6充分还原。这里使用Nafion是为了使DA还原生成的Pt纳米颗粒聚集生成具有更大表面积的花状铂纳米颗粒（PtNFs）。

1.3 葡萄糖传感器的制备

在电极修饰之前，首先将玻碳电极（GCE，Φ =4 mm）分别用0.3及0.05 μm的三氧化二铝（Al2O3）粉在麂皮上打磨、抛光，然后用蒸馏水洗净并依次用乙醇和蒸馏水超声清洗干净，最后将其置于室温下晾干备用。

取10 μL 12 mg/L的葡萄糖氧化酶 (GOD)溶液与5 mL的铂纳米颗粒溶液混匀，加入到5 mL 2%聚乙烯醇缩丁醛(PVB)的无水乙醇凝胶溶液中混合均匀，取10 μL上述混合液滴加到GCE上静置12 h，然后真空干燥，获得GOD-PtNFs纳米粒子修饰的玻碳电极(GOD-PtNFs/GCE)，保存在4℃冰箱中备用。

1.4 检测方法

采用MPI-E型电致化学发光分析系统对所修饰电极的电致化学发光行为进行研究，将所制得修饰电极置于测试底液为3 mL含有0.1 mol/L K2S2O8和不同浓度的葡萄糖PBS(pH7.4)缓冲溶液检测。

2 结果与讨论

2.1 纳米材料的表征

对所制备纳米材料的微观形态和微观结构用扫描电子显微镜(SEM)进行了表征。从图1上可以看出PtNFs是团簇的花状结构，说明加入少量的Nafion能够使得合成的铂纳米颗粒具有更大的表面积。

图1 PtNFs扫描电镜表征图Fig.1 SEM of PtNFs

2.2 GOD用量的选择

实验考查了酶电极GOD-PtNFs/GCE在制备过程中受不同浓度GOD用量的影响。当GOD浓度分别为2、4、8、12、16、20 mg/L时，所制备的传感器对3.0×10-5mol/L葡萄糖的响应电流情况如图2所示。由图2可以看出，电极的ECL响应信号强度随着GOD浓度的增加而增大，在12 mg/L时达到饱和不再增大，由此可以确定GOD的最佳浓度为12 mg/L。

图2 GOD-PtNFs受不同浓度GOD用量的影响Fig.2 Effect of the GOD concentration on the GODPtNFs/GCE biosensor

2.3 葡萄糖传感器的响应性能

2.3.1 传感器的线性范围及检测限

实验考查了酶电极GOD-PtNFs/GCE对不同浓度葡萄糖的响应情况。随着葡萄糖浓度的增加，电极响应的峰电流值也逐渐增加，图3为GOD-PtNFs/GCE响应葡萄糖的校正曲线。从图中可知，传感器在1.00×10-5~3.00×10-4mol/L范围内的响应电流与葡萄糖浓度成线性关系，其校正曲线方程可拟合为：I=28.302 c+3476.6，(c为葡萄糖浓度；I为峰电流响应值，r2=0.99)。检测下限为0.33×10-6mol/L。

图3 ECL生物传感器在不同的葡萄糖浓度下的ECL-时间曲线，插入图为线性斜率图Fig.3 ECL-time curves of the biosensor with different concentrations of glucose in 0.1 mol/L PBS(pH7.4) containing 0.1 mol/L K2S2O8.glucose concentration:(a)10 μmol/L,(b)30 μmol/L,(c)80 μmol/L,(d)160 μmol/L,(e) 240 μmol/L,(f)300 μmol/L.The insert is the relationship between ECL intensity and the concentration of glucose. The voltage of the photomultiplier tube was set at 800 V.Scan rate,100 mV/s

2.3.2 传感器的重现性、选择性、稳定性和使用寿命

将按照上述方法制备好的GOD-PtNFs/GCE在1.60×10-4mol/L的葡萄糖溶液中来回进行6次测试，表明该传感器在两种溶液响应的相对标准偏差为0.50%,说明传感器的重现性较好。选择性是传感器能否应用的一个重要考核指标。实验考察了该电极在1.60×10-4mol/L葡萄糖溶液中分别加入20倍浓度的抗坏血酸、尿酸、果糖后的电流响应情况，结果没有发现明显的电流增强响应信号，说明抗坏血酸、尿酸、果糖等对葡萄糖传感器无明显的干扰。

传感器的稳定性是分析检测应用的一个重要性能指标。 实验考察了该电极在 1.60×10-4mol/L葡萄糖溶液中连续检测9圈，其ECL相应响应过程如图4所示，其ECL电流响应的相对标准偏差为3.86%，说明该传感器具有较好的稳定性。并且该电极经过15 d使用后，响应电流下降至最初值的90%，说明传感器具有良好的稳定性且至少可以使用12 d。

图4 生物传感器的稳定性Fig.4 The stability of the proposed ECL biosensor

2.3.3 生物传感器催化机理

PtNFs-GOD修饰到电极表面后，GOD催化底液中的葡萄糖产生H2O2，H2O2被仿HRP酶作用的PtNFs催化原位产生大量的共反应剂O2，其涉及的反应用公式表示如下：

从而循环往复，大大增强ECL光信号，进而大大提高了反应灵敏度。可能的机理为[8]：

2.3.4 传感器的回收率与分析应用

将按照上述方法制备好的GOD-PtNFs/GCE，对实验室配制的5个葡萄糖样品溶液的浓度进行了加标回收测试，结果表明其回收率在96.81% ~100.98%之间（见表1），说明GOD-PtNFs/GCE能够较好地应用于葡萄糖的快速检测。

表1 传感器的回收结果（n=5）Tab.1 The recovery of the glucose biosensor

3 结论

该文探讨了一种基于花状铂纳米颗粒修饰电极用于葡萄糖检测的生物传感器。提出了仿双酶循环反应原位产生共反应剂促进ECL反应的有效放大策略，成功的提高了检测灵敏度，扩大了检测范围，所构建的生物传感器也显示了良好的选择性、重现性和稳定性。因此，该工作提供了一个新颖的信号放大策略并可望应用于实际样品葡萄糖含量的检测。

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[3]董晓东,侯宛玲,苏绍哲,等.高效液相色谱法测定葡萄糖和甘露醇[J].分析化学,2000,28(5):656-657.

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Electrochemiluminescence biosensor based on PtNFs-GOD composite materials for the determination of glucose

Liao Ni*
(College of Biological and Chemical Engineering,Panzhihua University,Panzhihua 617000,China)

In this paper,a novel electrochemiluminescence biosensor for the detection of glucose was proposed based on flower-like platinum nanoparticles(PtNFs)via an one-pot chemical synthesis method.Glucose biosensors were formed in optimal conditions with glucose oxidase (GOD)immobilized glassy carbon electrode,which was composed of platinum nanoparticles and polyvinyl butyral(PVB)with sol-gel method.The present glucose biosensor showed a wide linear range of 1.00×10-5mol/L to 3.00×10-4mol/L,with a low detection limit of 0.33×10-6mol/L for detecting glucose.The glucose biosensor possessed nice reproducibility,selectivity,stability and long lifetime with a recovery of 96.81%~100.98%,which can be well applied to determination of glucose in actual samples.

flower-like structures platinum nanoparticles；electrochemiluminescence biosensor；glucose

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