下调HEATR3表达对结直肠癌HCT116细胞增殖及Akt信号通路的影响

王倩，鲍永华,陈志国，杨万才

(新乡医学院基础医学院，河南新乡453003)



下调HEATR3表达对结直肠癌HCT116细胞增殖及Akt信号通路的影响

王倩，鲍永华,陈志国，杨万才

(新乡医学院基础医学院，河南新乡453003)

摘要：目的观察下调HEATR3表达对结直肠癌HCT116细胞增殖以及Akt信号通路的影响，探讨HEATR3在结直肠癌中的作用。方法将HCT116细胞随机分为观察组和对照组，分别转染HEATR3的干扰RNA及无义序列；采用MTT法检测细胞增殖的光密度(OD)值，采用实时荧光定量PCR法检测HEATR3 mRNA，Western blot法检测HEATR3、Akt、p-Akt。结果两组转染前细胞增殖无差异，与对照组同时点比较，观察组转染后24、36、48 h时细胞增殖的OD值均降低(P均<0.05)；转染48 h，观察组HEATR3 mRNA及蛋白表达量分别为0.49±0.04、0.03±0.01，对照组分别为2.08±0.45、0.47±0.01，P均<0.05。观察组Akt、p-Akt蛋白表达量分别为0.49±0.01、0.05±0.01，对照组分别为0.96±0.01、0.92±0.01，P均<0.05；结论下调HEATR3表达可通过抑制Akt信号通路降低结直肠癌细胞的增殖能力，HEATR3可能是结肠癌发生、发展中的一个重要癌基因。

关键词：结直肠癌；HEATR3基因；细胞增殖；蛋白激酶B

结直肠癌(CRC)在美国居恶性肿瘤第3位，在肿瘤病死率中居第2位[1]。在中国，CRC在恶性肿瘤发病率中排第4位，并有上升的趋势[2]。研究发现，CRC的发生、发展与抑癌基因的失活或表达下调以及癌基因的激活或表达上调相关，它们的改变会导致肿瘤信号通路的激活，如Wnt/β-catenin[3～5]、炎症信号通路[6, 7]、Akt信号通路[8～10]等。HEATR3是近两年通过高通量筛选发现的基因，目前对其了解甚少，只发现HEATR3与德系犹太人的克罗恩病发生相关[11]。2014年6～12月，我们针对HEATR3设计了高效的干扰RNA(siRNA)，观察其对CRC细胞增殖以及Akt信号通路的影响，探讨其在CRC中的作用。

1材料与方法

1.1材料人CRC细胞系HCT116购自中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所；HEATR3的siRNA及其无义序列(对照NC)由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成；RPMI 1640细胞培养基(Corning公司)，胰酶(上海碧云天生物技术有限公司)，胎牛血清(Thermo Fisher Scientific公司)；Western及IP细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；DMSO、MTT、逆转录试剂5X All-in-One RT Mastermix(ABM 公司)，TRIzol 试剂(Invitrogen公司)，EvaGreen qPCR Mastermix ROX(ABM公司)；Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)；BCA蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)，ECL试剂(上海碧云天生物技术有限公司)；Akt抗体(Proteintech公司)，p-Akt、GAPDH抗体(Cell Signaling Technology公司)，HEATR3抗体(Proteintech公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及转染用RPMI 1640细胞培养基培养HCT116细胞，细胞培养箱温度37 ℃、5% CO2、相对湿度95%。细胞传代后用胰酶消化，接种至60 mm细胞培养皿和96孔板中；将细胞随机分为观察组和对照组，分别利用Lipofectamine 3000转染HEATR3-siRNA和对照NC，按照试剂盒说明书操作。

1.2.2HEATR3 mRNA检测采用实时荧光定量PCR法。转染48 h，收集两组细胞。以TRIzol试剂提取RNA，用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA浓度，-80 ℃保存。利用逆转录试剂盒5X All-in-One RT Mastermix对RNA进行逆转录，所得cDNA-80 ℃保存。通过primer3.0在线软件设计引物：HEATR3上游引物5′-CTCCTCTCTCGGTGGTCTGT-3′，下游引物5′-CTCGGGTGCTGGAGCTTTTC-3′，片段长度191 bp；β-actin上游引物5′-CGCCAAGCACGATGAAGA-3′，下游引物5′-CTGTTGGAAGGTGGAAAGAGATG-3′，片段长度149 bp，引物由上海生工公司合成。利用EvaGreen qPCR Mastermix ROX荧光定量PCR试剂盒在StepOnePlus Real-Time PCR System上进行荧光定量PCR检测，PCR体系及反应条件按照试剂盒说明书操作。每个标本重复3次，取平均Ct值，以2-ΔΔCt值表示mRNA表达水平。

1.2.3细胞增殖观察采用MTT法。分别于转染前(0 h)及转染后24、36、48 h，向96孔板的细胞中加入MTT溶液10 μL，继续培养4～6 h后除去细胞培养基；每孔加入100 μL DMSO溶液，轻轻振荡10 min；待紫色结晶完全溶解后，置于多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)中，检测570 nm波长下的光密度(OD)值，以此表示细胞增殖情况。

1.2.4HEATR3、Akt、p-Akt检测采用Western blot法。收集60 mm培养皿中转染48 h的细胞，加入Western及IP细胞裂解液提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。加入上样缓冲液后煮蛋白5 min，采用Western blot法检测HEATR3、Akt、p-Akt、GAPDH，应用全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)和ECL溶液拍照并保存。通过Image J软件分析条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度比值表示蛋白表达量。

2结果

2.1两组HEATR3 mRNA及蛋白比较转染48 h，观察组HEATR3 mRNA及蛋白表达量分别为0.49±0.04、0.03±0.01，对照组分别为2.08±0.45、0.47±0.01，P均<0.05。

2.2两组细胞增殖情况比较见表1。

表1　两组细胞增殖情况比较±s)

注：与对照组同时点比较，*P<0.05。

2.3两组Akt、p-Akt蛋白表达比较转染48 h，观察组Akt、p-Akt蛋白表达量分别为0.49±0.01、0.05±0.01，对照组分别为0.96±0.01、0.92±0.01，P均<0.05。

3讨论

近年来研究发现，Akt信号通路可通过其下游信号转导调控细胞凋亡和细胞周期，并且对端粒酶活性、肿瘤血管的生成以及肿瘤的侵袭有促进作用。因此，Akt信号通路在肿瘤的研究具有十分重要的意义。Akt可以通过对细胞周期的直接作用传递生存信号。通过使用PI3K抑制剂可以抑制CRC细胞系Colo205内Cyclin D的表达；而p-Akt可以逆转PI3K抑制剂对Cyclin D的抑制作用，而且这种逆转作用不能被PI3K抑制剂所拮抗；说明Akt可以促进Cyclin D的表达[11]。还有研究发现，Mdm2是Akt通路下游的一个作用底物，它可以特异性地被Akt磷酸化，从而使胞质中的Akt-Mdm2复合物迅速解离、Mdm2进入细胞核并与p53结合，进而促进p53降解并抑制其功能；而p53 则可以通过多种途径影响细胞周期的进行[12]。另外，研究发现Akt与肿瘤永生化因子端粒酶逆转录酶催化亚基hTERT有关[13]。在黑色素细胞瘤细胞系SK-MEL28中发现，hTERT可能作为Akt的作用底物而被激活[14]。

HEATR3作为一种新发现的蛋白，其作用机制尚不清楚。目前，研究发现HEATR3与德系犹太人的克罗恩病发生相关，其通过激活NOD2信号通路从而对德系犹太人的克罗恩病发生起着促进作用[15]。而克罗恩病与CRC的发生密切相关，由此可以部分地支持本研究中HEATR3作为一种癌基因的观点。本研究结果显示，在HCT116细胞中下调HEATR3表达能够明显抑制Akt以及p-Akt的表达，从而通过Akt信号通路对CRC细胞的增殖起着重要的调节作用。今后我们将进一步研究HEATR3对于其他CRC细胞系的影响，并探讨HEATR3影响CRC发生、发展的其他作用机制。

参考文献：

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2012,62(1):10-29.

[2] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer, 2010,127(12):2893-2917.

[3] Herbst A, Kolligs FT. Wnt signaling as a therapeutic target for cancer[J]. Methods Mol Biol, 2007(361):63-91.

[4] Buchanan FG, DuBois RN. Connecting COX-2 and Wnt in cancer[J]. Cancer Cell, 2006,9(1):6-8.

[5] Jass JR. Colorectal cancer: a multipathway disease[J]. Crit Rev Oncog, 2006,12(3-4):273-287.

[6] Grivennikov SI. Inflammation and colorectal cancer: colitis-associated neoplasia[J]. Semin Immunopathol, 2013,35(2):229-244.

[7] Saleh M, Trinchieri G. Innate immune mechanisms of colitis and colitis-associated colorectal cancer[J]. Nat Rev Immunol, 2011,11(1):9-20.

[8] Itoh N, Semba S, Ito M, et al. Phosphorylation of Akt/PKB is required for suppression of cancer cell apoptosis and tumor progression in human colorectal carcinoma[J]. Cancer, 2002,94(12):3127-3134.

[9] Agarwal A, Das K, Lerner N, et al. The AKT/I kappa B kinase pathway promotes angiogenic/metastatic gene expression in colorectal cancer by activating nuclear factor-kappa B and beta-catenin[J]. Oncogene, 2005,24(6):1021-1031.

[10] Lugli A, Zlobec I, Minoo P, et al. Role of the mitogen-activated protein kinase and phosphoinositide 3-kinase/AKT pathways downstream molecules, phosphorylated extracellular signal-regulated kinase, and phosphorylated AKT in colorectal cancer-a tissue microarray-based approach[J]. Hum Pathol, 2006,37(8):1022-1031.

[11] Zhang W, Hui KY, Gusev A, et al. Extended haplotype association study in Crohn′s disease identifies a novel, Ashkenazi Jewish-specific missense mutation in the NF-kappa B pathway gene, HEATR3[J]. Genes Immun, 2013,14(5):310-316.

[12] Muise-Helmericks RC, Grimes HL, Bellacosa A, et al. Cyclin D expression is controlled post-transcriptionally via a phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent pathway[J]. J Biol Chem, 1998,273(45):29864-29872.

[13] Mayo LD, Donner DB. A phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway promotes translocation of Mdm2 from the cytoplasm to the nucleus[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(20):11598-11603.

[14] Datta SR, Brunet A, Greenberg ME. Cellular survival: a play in three Akts[J]. Genes Dev,1999,13(22):2905-2927.

[15] Kang SS, Kwon T, Kwon DY, et al. Akt protein kinase enhances human telomerase activity through phosphorylation of telomerase reverse transcriptase subunit[J]. J Biol Chem, 1999,274(19):13085-13090.

Effects of down-regulating HEATR3 on proliferation of colorectal cancer cells HCT116 and Akt signaling pathway

WANGQian,BAOYonghua,CHENZhiguo,YANGWancai

(XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

Abstract:Objective To observe the effects of down-regulating HEATR3 on cell proliferation and Akt signaling pathway in colorectal cancer cell line HCT116, and to determine the role of HEATR3 in the colorectal cancer. MethodsHCT116 cells were randomly divided into the observation group and control group which were separately transfected with the siRNA of HEATR3 and nonsense sequence. The optical density (OD) value of cell proliferation was detected by MTT assay, the expression level of HEATR3 mRNA was detected by real-time fluorescent quantificative PCR, and the protein levels of HEATR3, Akt and p-Akt were detected by Western blotting. ResultsThere was no difference in the cell proliferation between the two group before transfection. The OD values of cell proliferation in the observation group were lower than those of the control group at 24 h, 36 h and 48 h after transfection (all P<0.05); the HEATR3 mRNA and protein levels in the observation group were 0.49±0.04, 0.03±0.01, and those were 2.08±0.45 and 0.47±0.01 in the control group at 48 h after transfection (all P<0.05). Akt and p-Akt protein levels in the observation group were 0.49±0.01 and 0.05±0.01, and those were 0.96±0.01 and 0.92±0.01 in the control group after transfection (all P<0.05). ConclusionThe down-regulation of HEATR3 can decrease the cell proliferation of colorectal cancer cells through inhibiting Akt signaling pathway, and HEATR3 may act as an important oncogene in the occurrence and development of colorectal cancer.

Key words:colorectal carcinoma; HEATR3 gene; cell proliferation; protein kinase B

(收稿日期：2015-12-01)

通信作者简介：鲍永华(1976-)，女，教授，主要研究方向为肿瘤免疫。E-mail： baoyonghua2005@126.com

中图分类号：R735.3

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)10-0004-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.002

作者简介：第一王倩(1988-)，女，在读硕士，主要研究方向为肿瘤免疫。E-mail： wangqian88718@126.com

基金项目：国家自然科学基金重大研究计划项目(91229115)；河南省肿瘤发生和转移机制创新团队(13IRTSTHN013)；

新乡医学院研究生科研创新支持计划项目(YJSCX20408Z)。