B淋巴细胞在抗CD45RB 抗体诱导的移植免疫耐受中的作用*

邓春艳，　张国超，　邓绍平，　任莉莉，　蒋锦杏，　俞丽娜，　齐　晖，　李富荣

(暨南大学第二临床医学院/深圳市人民医院干细胞与细胞治疗重点实验室/广东 深圳 518020)



B淋巴细胞在抗CD45RB 抗体诱导的移植免疫耐受中的作用*

邓春艳，张国超，邓绍平，任莉莉，蒋锦杏，俞丽娜，齐晖，李富荣△

(暨南大学第二临床医学院/深圳市人民医院干细胞与细胞治疗重点实验室/广东 深圳 518020)

[摘要]目的： 探讨B淋巴细胞在抗CD45RB抗体诱导的移植免疫耐受中的作用。方法: 抗CD45RB抗体对BALB/c裸鼠进行预处理后制备脾脏单细胞悬液，与BALB/c小鼠T淋巴细胞和C57BL/6小鼠脾细胞混合培养，流式细胞术分析Th1、Th2、Treg和Tm淋巴细胞。以B6.μMT-/-小鼠为受体、BALB/c小鼠为供体建立皮肤移植模型，移植后向受体鼠腹腔注射抗CD45RB 单抗，监测脾淋巴细胞 CD3+CD45RBhi细胞比例。在混合淋巴培养过程中加入抗 CD45RB单抗，分离 B 细胞，建立以BALB/c 小鼠为供体、B6.μMT-/-小鼠为受体的心脏移植模型，通过尾静脉注射B 细胞给 B6.μMT-/-小鼠，观察受体鼠生存期和B细胞分布。结果: 在裸鼠体内用抗 CD45RB 抗体处理过的 B 淋巴细胞，与 T 淋巴细胞混合培养时，可使Treg和Th2 淋巴细胞比例明显升高，Th1淋巴细胞的比例明显下降，Tm细胞无明显变化。在体内B淋巴细胞缺失的情况下，抗 CD45RB 抗体依然能够降低 T 细胞表面 CD45RB 的表达，与对照组B淋巴细胞存在组相比，抗 CD45RB 抗体对 T 淋巴细胞表面 CD45RB 下调更为快速，但最终CD3+CD45RBhiT 细胞比例无明显变化。体外抗 CD45RB 抗体处理过的B淋巴细胞可以延长受体鼠的生存时间。B6.μMT-/-鼠在接受抗CD45RB抗体处理的B细胞并进行同种异体心脏移植后，B细胞可向胸腺迁移。结论: 在抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中，B淋巴细胞可能通过介导各T淋巴细胞亚群比例发挥着重要作用，且在中枢耐受中也起到一定作用，但是仅靠B淋巴细胞无法形成完全耐受。

[关键词]CD45RB抗体； 移植； 免疫耐受

CD45分子是一种广泛地表达在造血系细胞如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等表面的跨膜糖蛋白，是细胞膜上信号转导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟、功能调节及信号传递中具有重要意义。CD45RB是CD45的一种异构体，主要表达在 T、B、DC 细胞表面。大量实验证明针对CD45RB的单克隆抗体能够在同种异体移植模型中诱导移植物长期存活，并在受体体内形成特异性的免疫耐受[1-5]。目前针对抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受调节机制的研究大多集中在T细胞介导的免疫调节功能。

近年的研究发现在CD45RB单抗诱导的移植免疫耐受中必须有宿主B淋巴细胞的参与[6-7]，但相关作用机制尚不清楚。本实验通过研究在B细胞存在或缺失状态下，抗CD45RB 抗体在体内外对T细胞的作用及诱导移植免疫耐受的影响等，阐述B淋巴细胞在抗 CD45RB抗体诱导的移植免疫耐受中可能发挥的作用机制。

材料和方法

1实验动物

近交系BABL/c小鼠(6～8周龄)，雌雄不限，购自广东省医学实验动物中心；近交系雌性C57BL/6小鼠(6～8周龄)及雄性BABL/c裸鼠购自南方医科大学动物实验中心； B6.μMT-/-鼠(B细胞缺失，C57BL/6同源, 6～8周龄)，雌雄各半，购自Jackson实验室。动物实验均在深圳市疾病控制中心 (SPF级动物实验中心)完成，所用动物实验符合动物伦理学要求。

2主要试剂

抗CD45RB单克隆抗体购自BioXcell；尼龙柱购自Wako；抗CD3-PECY5、CD19-PE、CD4-PECY5、CD25-Alexa Fluro、CD127-PE、 CD8-FITC、CD44-PE、CD62L-FITC、CD45RB-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-PE及相应的同型对照等流式抗体购自eBioscience；流式破膜剂购自Beckman；淋巴细胞分离液购自达科为生物技术有限公司；丝裂霉素、PMA、ionomycin等购自Sigma；DMEM和RPMI-1640培养基购自Thermo;胎牛血清购自HyClone。

3主要方法

3.1抗CD45RB抗体对BALB/c裸鼠进行预处理将BALB/c裸鼠分为2组，每组各5只。 A 组(n=5)在 0、1、3、5、7 d分别腹腔注射100 μL浓度为1 g/L的抗CD45RB单抗;B组(n=5)在0、1、3、5、7 d腹腔注射 100 μL 生理盐水，7 d后待用。

3.2抗CD45RB抗体预处理的B淋巴细胞对T淋巴细胞亚群的作用预处理的BALB/c裸鼠，无菌取脾脏制备脾淋巴细胞悬液，采用尼龙柱分离法分离B淋巴细胞备用。分别以抗CD3-PEcy和CD19-PE标记，流式细胞术检测CD3+T细胞纯度>90%,CD19+B细胞>90%，将提取的C57BL/6小鼠脾淋巴细胞与丝裂霉素C共孵育后作为刺激细胞。将3 种细胞按1∶2∶1的比例加至6孔板混合培养，实验分为实验组：BALB/c小鼠T淋巴细胞+B淋巴细胞(来自抗CD45RB抗体预处理BALB/c裸鼠)+C57BL/6脾淋巴细胞；对照组：BALB/c小鼠T淋巴细胞+B淋巴细胞(来自生理盐水预处理BALB/c裸鼠)+C57BL/6脾淋巴细胞。

共培养0、1、3、5、7 d时每组取3个复孔分别收获悬浮细胞，流式细胞术检测T细胞亚群包括Treg(CD4+CD25+CD127-)、Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)和Tm(CD4+CD62L-CD44hi)。取待检测细胞(1×106)于试管中，分别加入抗体及相应同型对照进行细胞免疫荧光染色。IL-4、IFN-γ等细胞内细胞因子的检测需先经过PMA及BFA刺激，染色前采用破膜剂进行破膜处理。孵育后流式细胞仪(FACSC Canto Ⅱ，Beckton Dickinson)分别进行检测。

3.3抗CD45RB抗体对B细胞缺馅鼠CD3+CD45RBhiT细胞的影响取BALB/c小鼠耳背部皮肤移植到B6.μMT-/-或C57BL/6小鼠背部，移植方法参照文献进行[8]。实验按照随机对照原则分为4组，每组受体鼠24只。A组(实验组)和B组均为B6.μMT-/-鼠移植 BALB/c 鼠耳背皮肤； C组和D组均为C57BL/6鼠移植 BALB/c鼠耳背皮肤。移植后0、1、3、5、7 d，分别向 A、C 组受体鼠腹腔注射100 μL浓度为1 g/L的抗 CD45RB 单抗，B、D 组腹腔注射 100 μL 生理盐水。每组分别在腹腔注射后0、1、3、5、7、9 d取4只受体鼠脾脏，制备单细胞悬液，同上方法，流式细胞术检测CD3+CD45RBhi的百分率。

3.4抗CD45RB抗体处理的B淋巴细胞在同种异体心脏移植中诱导耐受的作用取8周龄雌性C57BL/6小鼠和8周龄雌性BALB/c小鼠，无菌取脾制成单细胞悬液。将C57BL/6小鼠脾淋巴细胞作为反应细胞，BALB/c小鼠脾淋巴细胞用丝裂霉素C处理后作为刺激细胞进行混合培养。实验组细胞在0、1、3、5、7 d分别加入1 g/L的抗CD45RB抗体10 μg，对照组加入PBS 10 μL。将混合培养淋巴细胞在第9天经尼龙柱法分离B淋巴细胞，调整细胞浓度2.5×1010/L。B6.μMT-/-鼠经尾静脉注射分别来自实验组和对照组的5×106B细胞后作为受体，BALB/c小鼠作为供体开始行同种异体的心脏移植，移植方法见文献[9]。每组小鼠各6只，每天通过视、触诊观察供心的搏动情况。以供心搏动有力，且小鼠存活72 h以上视为移植成功，记录移植小鼠的生存时间。

3.5B细胞经抗CD45RB抗体处理后向胸腺迁移状况的检测按照随机数字表法将60只B6.μMT-/-分为3组，每组20只。正常的B6小鼠 B细胞约5×106经抗CD45RB抗体10 μg处理，CFSE标记上述细胞后通过尾静脉向实验组和 B6.μMT-/-鼠注射，将 BALB/c 小鼠心脏移植到B6.μMT-/-鼠，方法同前。以接受不经抗CD45RB抗体处理组的B细胞移植受体鼠作为对照组1，接受抗CD45RB抗体处理组的B细胞但不做心脏移植的 B6.μMT-/-鼠为对照组2。在1、3、5、7、10 d每组取4只小鼠胸腺制备单细胞悬液，通过流式细胞仪监控CD19+CFSE+B细胞迁移到胸腺的程度。

4统计学处理

所有结果以 SPSS 13.0 统计软件分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，统计方法使用两样本t检验和析因设计的方差分析，各组均数间的两两比较采用Bonferroni校正的t检验,生存期采取log-rank检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1抗CD45RB抗体处理过的B细胞在体外对T 细胞亚群的影响

为了观察B淋巴细胞在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中对 T 细胞亚群的影响，我们将来自抗CD45RB抗体注射后BALB/c裸鼠的B细胞与BALB/c小鼠的T细胞一起作为反应细胞进行混合淋巴细胞培养。混合淋巴培养7 d内，2组调节性Treg细胞比例均呈逐渐上升趋势，但实验组中上升幅度明显高于对照组(P<0.05)；2组Tm细胞比例呈逐渐上升趋势，但上升幅度无明显差别；2组Th1细胞阳性率均呈逐渐上升趋势，实验组升幅明显低于对照组；Th2细胞阳性率也呈逐渐上升趋势，但实验组升幅明显高于对照组；实验组Th1/Th2较对照组降低(P<0.05),见图1。

2抗CD45RB抗体对B细胞缺陷鼠外周成熟T细胞的影响

为了解抗CD45RB抗体在B细胞缺失的情况下，对同种异体移植模型外周T细胞的影响，我们选取体内B细胞缺陷小鼠B6.μMT-/-鼠作为受体进行同种异体皮肤移植，并与非B细胞缺陷鼠进行比较。A 组B6.μMT-/-鼠注射抗CD45RB抗体后，第1天的CD3+CD45RBhi细胞在CD3+细胞中的比例即降到 40%左右，继续注射抗体无法使其比例再降低。B组B6.μMT-/-鼠未使用抗CD45RB抗体，CD3+CD45RBhi的比例随时间几乎没有变化。C 组 C57BL/6 鼠在注射抗 CD45RB抗体后，CD3+CD45RBhi的比例随时间逐渐降低，在第9天降到了和B细胞缺陷鼠A组相同的水平(P<0.05)。D组C57BL/6鼠在移植皮肤之后注射生理盐水，随时间的延长，CD3+CD45RBhi的比例呈明显升高，见图1。

3体外诱导耐受的B细胞对心脏移植受体鼠生存期的影响

为了观察抗CD45RB抗体对外周耐受的诱导是否仅仅依靠B细胞就可以完成，我们在体外用抗CD45RB抗体诱导B细胞的耐受，将诱导耐受后的B细胞静脉注入B细胞缺陷鼠体内，观察心脏移植的生存期。在体外混合培养6 h后观察细胞形态，可见未加抗体组的淋巴细胞分布较均匀，无细胞成团现象。而加入抗体组的细胞大部分形成大小不等的团状分布，散在单个分布细胞较少。将抗CD45RB抗体处理过的C57BL/6小鼠B细胞分离出来，经尾静脉注射给同种异体心脏移植受体B细胞缺陷B6.μMT-/-鼠能延长移植物存活时间。实验组移植心脏平均存活时间为(14.3±3.5)d，对照组移植心脏平均存活时间为(4.2±1.2)d。经log-rank检验，实验组移植心脏存活时间较对照组明显延长(P<0.05)，见图2。

Figure 1.The influence of anti-CD45RB mAb-disposed B cells on T-cell subgroups. Mean±SD.n=3～4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsgroup C.

图1抗CD45RB抗体处理过的B细胞对T细胞亚群的影响

Figure 2.The influence ofinvitroinduced tolerance B cells on the lifetime of rats after allogeneic heart transplantation. A: the cells in mixed lymphocyte culture without anti-CD45RB mAb (×200); B: the cells in mixed lymphocyte culture with anti-CD45RB mAb (×200); C: the survival curve after transplantation (n=6).

图2体外诱导耐受的 B 细胞对同种异体心脏移植受体鼠生存期的影响

4B细胞经抗CD45RB抗体处理后向胸腺迁移状况

实验组于第5天在胸腺中开始检测到少量经 CFSE 标记过的B细胞[(3.13±0.53) %]，随后逐渐增多，第10天达到约(8.32±1.21) %；对照组1中B细胞未经过抗CD45RB抗体处理，胸腺中未出现明显的CD19+CFSE+B细胞；对照组2虽然接受了抗CD45RB抗体处理的B细胞，但未进行移植，前期胸腺中未能检测到CD19+CFSE+B细胞，直到第10天，在胸腺中仅检测到微量B细胞[(2.22±0.13) %],见图3、表1。

Figure 3.The migration of B cells treated with anti-CD45RB mAb to the thymus.Control 1: B cells was untreated with anti-CD45RB mAb in the transplantion model; control 2: B cells was treated with anti-CD45RB mAb but without transplantation.

图3B细胞经抗CD45RB抗体处理后向胸腺迁移状况

讨论

B 细胞是体内数目最多的抗原提呈细胞，也是体内惟一能产生抗体的细胞，但是它在免疫耐受中发挥的作用仍然是有争议的，它可能对免疫排斥具有两种决然不同的作用。在某些情况下B细胞会加速排斥反应、促进细胞免疫，清除B细胞可能延长移植物存活[10-12]。而在另一些研究中，B 细胞在抗CD45RB抗体耐诱导的耐受中被证明是必须的[6-7, 13]。

表1B细胞经CD45RB抗体处理后向胸腺迁移状况

Table 1.The migration of B cells treated with anti-CD45RB mAb to the thymus (%. Mean±SD.n=4)

Time(d)Control1Control2Experimental10.91±0.360.88±0.610.86±0.1830.89±0.170.93±0.230.93±0.4151.21±0.260.81±0.183.13±0.53*#71.53±0.230.79±0.336.26±0.71*#100.95±0.112.22±0.138.32±1.21*#

*P<0.05vscontrol 1;#P<0.05vscontrol 2.

本实验研究发现，在体内用抗CD45RB抗体对裸鼠 B 细胞进行处理，处理后的 B 细胞在体外能上调裸鼠体内缺少的T细胞。用抗CD45RB 抗体进行处理时，体内B细胞在缺少胸腺、无T细胞和没有抗原刺激的情况下，一方面抗CD45RB抗体可能通过竞争性结合B细胞表面CD45RB，从而阻断活化信号的传导，起到抑制增殖的作用；另一方面抗CD45RB抗体可能改变B细胞表面某些分子的表达，使B细胞转变成介于静息状态B细胞和耐受状态B细胞之间的一种状态。当把此种B细胞取出体外，在混合淋巴细胞培养中与T细胞、抗原刺激相混合时，这种中间状态可能改变B细胞提呈抗原、与 T 细胞共刺激等作用，从而使 Th2、Treg 细胞比率升高，Th1 细胞比率下降，T 细胞反应朝向耐受的方向发展。对Tm细胞无明显影响可能是因为T 细胞第一次遇到外界抗原刺激，记忆T细胞增殖作用占主导地位，而抗CD45RB 抗体处理过的 B 细胞对其增殖的抑制影响被忽略所致。

Blaylock等[14]实验证实， 抗CD45RB抗体的免疫调节作用与清除外周血中某种特异性 T 细胞亚群有关。有研究[15-16]证明抗 CD45RB抗体可改变受体外周血CD45RBhiT细胞和CD45RBloT细胞的比值来诱导耐受，CD45RBloCD4+T能够表达调节性转录因子Foxp3，分泌细胞因子IL-4，且具有调节作用，而CD45RBhiCD4+T低表达Foxp3，分泌介导排斥反应的Th1类细胞因子，且具有效应细胞的作用。因此，调节性CD45RBloT和效应性CD45RBhiT之间平衡的改变对于CD45RB单抗的免疫功能是至关重要的。本实验发现，在B细胞缺失的情况下，抗CD45RB抗体对脾内CD45RBhiT的减少作用依然存在，只是减少的方式与B细胞存在的情况下有所不同。B细胞缺陷鼠皮肤移植注射抗CD45RB抗体后，第1天CD3+CD45RBhi细胞在CD3+阳性细胞中的比例就降到40%左右，以后再注射抗体都无法使其比例再降低。而C57BL/6皮肤移植鼠在注射抗CD45RB 抗体后，CD3+CD45RB+的比例随时间逐渐降低，在第9天降到了和 B 细胞缺陷鼠实验组相同的水平。原因可能是CD45RB广泛表达在T、B细胞表面，在B细胞存在的情况下，B细胞能够和 T 细胞竞争抗CD45RB的结合位点，不至于使CD45RBhiT细胞降低过快。C57BL/6小鼠生理盐水组CD45RBhiT 细胞比例稍有增加，而B6.μMT-/-鼠生理盐水组基本没有变化，可能是因为在接受抗原刺激时，作为抗原提呈细胞的B细胞可上调 T细胞表面CD45RB分子的表达，CD45RBhiT细胞具有效应细胞的作用，从而产生更为强烈的免疫反应。实验结果说明，在抗CD45RB抗体减少外周CD45RBhiT细胞的作用中，B细胞起到一定的作用，但并不是决定性的作用。B细胞可以使CD45RBhiT细胞的减少不至于过快，这也可能是抗CD45RB抗体诱导耐受后，机体仍对其它抗原保持正常免疫反应的一个原因。

CD45RB诱导的免疫耐受中，B细胞起到重要作用，B细胞的缺失将导致诱导耐受的失败，但抗CD45RB 抗体对耐受的诱导仅仅依靠B细胞能形成吗？本实验在将体外诱导耐受的B细胞注入到B细胞缺陷鼠体内重建其免疫系统，可延长移植物的生存期，但不能诱导完全免疫耐受。这也说明了在抗CD45RB诱导耐受中B细胞的耐受并不能诱导整个机体的耐受，还需要T、DC等细胞的参与。在体外制备耐受B细胞时，我们注意到在混合淋巴细胞培养中加入抗CD45RB抗体后，B细胞聚集成团生长，单个散在细胞较少。其原因一方面可能是淋巴细胞竞争性地与抗CD45RB抗体结合，导致了一个抗CD45RB分子与多个淋巴细胞结合的现象。另一方面可能是细胞表面的CD54即细胞间黏附分子-1的表达上调，这类分子的上调直接影响到了细胞间的接触，导致了细胞的成团分布。本实验还发现应用抗 CD45RB加速了同种异体移植模型中B细胞向胸腺的迁移，进而提呈移植物特异性抗原给胸腺，介导了胸腺对能与移植物特异性抗原结合的T细胞的克隆清除，从而导致了中枢耐受，证实了在抗CD45RB抗体所介导的中枢耐受中需要宿主B细胞的参与。

综上所述，抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中，B细胞发挥着重要作用，但是，仅仅依靠B细胞无法形成完全耐受。免疫耐受的诱导是一个多种机制参与的免疫调节过程。我们需要对抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受调节规律进行更深入的研究，才能够更好地发掘抗CD45RB抗体作为新的免疫抑制药物在临床移植中的应用潜力。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Role of B cells in CD45RB antibody-induced transplantation immune tolerance

DENG Chun-yan, ZHANG Guo-chao, DENG Shao-ping, REN Li-li, JIANG Jin-xing, YU Li-na, QI Hui, LI Fu-rong

(TheKeyLaboratoryofStemCellandCellularTherapy,ShenzhenPeople’sHospital,TheSecondClinicalMedicalCollege,JinanUniversity,Shenzhen518020,China.E-mail:frli62@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of B cells in CD45RB antibody-induced transplantation immune tolerance. METHODS: Single cell suspension was made from the spleen of BALB/c nude mice disposed by CD45RB antibody, then mixed cultured with T cells of BALB/c mice and spleen cells of C57BL/6 mice. The Th1, Th2, Treg and Tm cells were monitored by flow cytometry during the culture process. The skin graft model was set up with B6.μMT-/-mice as receptors and BALB/c mice as donors. CD45RB antibody was intraperitoneally injected into the receptors after transplantation and then CD3+CD45RBhicells were detected by flow cytometry. In another mixed lymphocyte culture, CD45RB antibody was added, and then B cells were isolated and injected into B6.μMT-/-mice through the tail vein. The heart transplantation model was established with B6.μMT-/-mice as receptors and BALB/c mice as donors， and then the survival and the migration of B cells to the thymus were observed. RESULTS: When T lymphocytes were co-cultured with B lymphocytes treated with anti-CD45RB monoclonal antibody (mAb) in vivo, the percentages of Th2 and Treg cells were up-regulated and Th1 cells were down-regulated, but Tm cells were not altered as compared with the control. In vivo without B lymphocytes, anti-CD45RB mAb also down-regulated the expression of CD45RB in T lymphocytes. The reduction was faster and the percentage of CD3+CD45RBhiT cells was not altered as compared with the control. The B lymphocytes treated with anti-CD45RB mAb in vitro prolonged the lifetime of receptor in heart transplantation model but failed to induce complete tolerance. After recieving B cells treated with anti-CD45RB mAb and allogeneic heart transplantation, B cells migrated to the thymus in B6.μMT-/-mice. CONCLUSION: B lymphocytes play a definite role in the transplantation immune tolerance induced by anti-CD45RB mAb through their affection on T-cell subgroups and also in the central tolerance. However, the induction of immune tolerance can not only rely on B cells.

[KEY WORDS]CD45RB antibody; Transplantation; Immune tolerance

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.017

[中图分类号]R392.4； R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel： 0755-22942450； E-mail: frli62@163.com

*[基金项目]国家973前期专项(No.2007CB516811)；国家自然科学基金资助项目(No.30772042)；深圳市科技计划(No.201001005)

[收稿日期]2015- 09- 01[修回日期] 2016- 01- 26

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0492- 07

杂志网址： http://www.cjpp.net