不同光照对雌性抑郁大鼠生殖系统的影响

狄贯腾，　王莎莉

(重庆医科大学神经科学研究中心，重庆　400016)



不同光照对雌性抑郁大鼠生殖系统的影响

狄贯腾，王莎莉△

(重庆医科大学神经科学研究中心，重庆400016)

[摘要]目的： 研究不同光照对雌性抑郁大鼠生殖系统的影响。方法: 将35只已成功建立抑郁模型的成年SPF级SD雌性大鼠随机分为抑郁模型组、微波硫灯组、热辐射灯组、日光灯组和LED灯组，并设立健康成年SPF级SD雌性大鼠为对照组，每组7只。在连续光照45 d后，阴道涂片法检测生殖周期，计算子宫和卵巢脏器系数比，ELISA方法检测血清中雌二醇(E2)、催乳素(PRL)、孕酮(PROG)及雄激素睾酮(T)含量，HE染色观察卵巢的组织病理学。结果: 与对照组相比，抑郁模型组大鼠生殖周期严重紊乱，子宫和卵巢脏器系数比明显下降(P<0.05)，E2、PRL、PROG及T的含量降低(P<0.05)，卵巢充血严重。微波硫灯照射可以改善雌性抑郁大鼠的生殖周期，上调E2、PRL、PROG及T水平，减轻卵巢充血组织病理学改变，热辐射灯、日光灯和LED灯照射对雌性抑郁大鼠的生殖周期、性激素水平及卵巢组织病理学变化没有明显作用。结论: 微波硫灯照射可以改善雌性抑郁大鼠的生殖功能。

[关键词]光照； 雌性抑郁大鼠； 生殖； 硫灯； 性激素

抑郁症是多种因素引起的、以显著持久的心境低落为主要特征的精神障碍，具有患病率高，复发率高，自杀率高的特点。据WHO统计，抑郁症已经成为世界第四大疾患[1]，且每年发病都有逐步增高的趋势，到2020年可能成为仅次于心脏病的第二大疾病。对其发病机制和有效防治方法的研究，已成为社会科学和生命科学共同关注的重大课题，具有特殊的重要性和迫切性。从性别角度来讲，女性抑郁症的患病率远高于男性，这可能是由于女性多愁善感、抗压能力弱、在社会中处于从属地位等原因造成的[2]。抑郁症发病与遗传、竞争压力、环境等多种因素相关，光照就是其中不容忽视的环境因素，例如低日照地区抑郁症的发病率就明显高于高日照地区[3]。因此光疗也就成为目前临床上治疗抑郁症常用的辅助手段，但是临床上光照种类多，强度从100 lx到10 000 lx，光波长从470 nm到660 nm不等，光照后的效果有差异[4-6]，也未见利用不同光照来观察对抑郁大鼠生殖系统影响的研究。因此我们选用了生活中最常用的4种光源，即热光源的微波硫灯(sulfur lamp；全光谱，模拟人工太阳浴)和热辐射灯(heat radiation lamp;俗称浴霸)以及冷光源的日光灯(fluorescent lamp)和发光二极管(light-emitting diode，LED)灯，观察它们对雌性抑郁大鼠的生殖系统结构与功能的影响。

材料和方法

1实验动物

健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠共60只，体重180～200 g，购自重庆医科大学实验动物中心，动物许可证号为SCKK(渝)2005-0001，饲养于SPF系统内。环境温度22～25 ℃，相对湿度50%～70%。

2主要仪器和试剂

实验用灯(重庆大学城建与规划学院提供)参数：微波硫灯(光亮度3 100 cd/m2，色温6 900 K，均匀度0.82)，热辐射灯(光亮度1 160 cd/m2，色温2 466 K，均匀度0.74)，日光灯(光亮度3 120 cd/m2，色温 6 500 K，均匀度0.84)，LED灯(光亮度3 100 cd/m2，色温6 500 K，均匀度0.79)；ELISA试剂盒(上海基免生物科技有限公司)；真空促凝采血管(上海科华检验医学产品有限公司)；HE染色试剂盒(北京蓝博斯特生物技术有限公司)。

3主要方法

3.1抑郁大鼠CUMS模型的建立及分组60只实验大鼠在进行行为学测试[旷场实验(计算总运动得分,即水平运动得分+垂直运动得分)、强迫游泳实验(记录不动时间)和糖水偏好实验(计算24 h糖水偏爱百分比即糖水消耗量/消耗总量)]后，从中随机选取7只为对照组(不给予任何刺激，自由摄食和饮水)，其余53只大鼠进行抑郁模型的建立。将建模成功的大鼠随机分为抑郁模型组(建模后不进行处理)、微波硫灯光照组、热辐射灯光照组、日光灯光照组和LED灯光照组，每组7只。接受35 d的慢性、轻度、不可预见性的应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)。应激形式有夹尾1 min、电刺激1 h(1～2 mA，1～10 s，1 Hz)、禁水24 h、禁食24 h、5 ℃冰水游泳5 min、昼夜颠倒24 h、水平震荡5 min、40 ℃环境暴晒5 min、鼠笼45°角倾斜24 h和湿垫料24 h。10种刺激随机分布到35 d中，每种出现3～4次，同种刺激3 d内不连续出现，建模期间同时进行一般行为学的观察(体重、摄食、精神状态和理毛情况)，建模35 d后，再次进行旷场实验、强迫游泳实验和糖水偏好实验测试，各组大鼠此3项测试数据结果在建模前后的差异均有统计学显著性(P<0.05)可判断为建模成功[7-9]。从中选取7只作为抑郁模型组大鼠，建模后不进行光照处理。

3.2光照处理从建模成功的大鼠中选取28只大鼠随机分为4组，置于温度24～26 ℃，相对湿度65%～66%的环境中，每日12:00～14：00点分别进行微波硫灯、热辐射灯、日光灯和LED灯照射，连续照射45 d。光照期间每天对实验动物进行一般行为学观察。

3.3生殖周期的检测(阴道涂片)用沾有生理盐水的细棉签在大鼠的阴道内轻旋2圈，然后均匀涂在干净的载玻片上，在200倍光镜下观察阴道脱落细胞的形态，照像。

3.4血清中性激素含量的检测光照结束后第20天开始，每天根据阴道涂片检测结果，选出处于动情期的大鼠，称重后，水合氯醛麻醉，心脏采血，分离血清，置于-20 ℃冰箱冷冻保存。ELISA方法检测血清中雌二醇(estradiol，E2)、催乳素(prolactin，PRL)、孕酮(progesterone, PROG)及雄激素睾酮 (testosterone，T)的浓度(检测由上海基免生物科技有限公司进行)。

3.5生殖系统标本的采集采血后迅速摘取其子宫和卵巢，剥去其周围的脂肪和结缔组织后称重，然后立即置于4%多聚甲醛中固定，计算子宫和卵巢的脏器系数(子宫重/体重×100%；卵巢重/体重×100%)。

3.6卵巢的形态学观测常规石蜡包埋卵巢，切片，苏木素-伊红(hematoxylin-eosinstaining，HE) 染色，光镜下观察,于每组7个动物标本中随机选取5个进行切片制作，每个标本制作6～8个切片，于100倍光镜下观察4个视野,照相,从中选取最为典型的视野进行分析。

4统计学处理

所有实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。用均数±标准差(mean±SD)的形式来表示数据，各组数据经检验服从正态分布且组间方差齐同后，采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结果

1一般情况

抑郁模型组与对照组相比，摄食量减少，体重增长缓慢，精神萎靡，反应迟钝，理毛次数明显减少，4种光照后，这些情况得到一定程度改善，见表1。

2抑郁模型组及光照组大鼠建模前后行为学测试

各组大鼠建模后旷场实验、强迫游泳实验和糖水偏好实验测试评分结果与建模前相比，差异具有统计学显著性(P<0.05)，见表2。

表1各组大鼠建模前后及光照后的体重

Table 1.The weight of the rats in each group after modeling and lighting (g. Mean±SD.n=7)

Group5dbeforestressing35dafterstressing45dafterlightingControl189±23235±23262±52*Depressivemodel219±37226±15243±17Sulfur190±41201±28232±18*#Heatradiation192±61205±33240±24*Fluorescent181±48208±26242±49*#LED218±41222±25246±18*

*P<0.05vs5 d before stressing;#P<0.05vs35 d after stressing.

表2大鼠建模前后旷场实验、糖水偏好实验和强迫游泳实验测试结果

Table 2.The results of open field test, sucrose preference test and force swimming test of the rats in each group before and after mo-deling (Mean±SD.n=7)

GroupNumberofcrossingsPercentageofsucroseconsumption(%)Unmobilitytime(s)BeforestressingAfterstressingBeforestressingAfterstressingBeforestressingAfterstressingDepressivemodel169±1888±51*96.6±1.777.9±7.9*18±1736±16*Sulfur175±1994±13*94.5±3.578.4±6.6*7±730±18*Heatradiation170±1389±51*95.1±2.476.9±8.7*21±2043±21*Fluorescent159±1884±41*94.3±3.579.7±5.2*15±1832±16*LED173±2161±18*93.5±3.881.9±6.9*15±1443±29*

*P<0.05vsbefore stressing.

3不同光照对雌性抑郁大鼠动情周期的影响

对照组动情周期规律一致，约为4～5 d，抑郁模型组动情周期呈现严重紊乱，主要体现为动情期紊乱，持续时间长短不一，长为8 d，短则3 d； 微波硫灯组动情周期较为一致，约为4～6 d；热辐射灯组、日光灯和LED灯组动情周期明显延长约6～8 d。各组未见细胞形态的明显变化。动情周期各时期阴道脱落细胞典型涂片见图1。

Figure 1.The vaginal exfoliated cells from the rats during the estrous cycle (vaginal smears， ×200).

图1大鼠动情周期各时期阴道脱落细胞形态

4不同光照对雌性抑郁大鼠血清中E2、PRL、PROG和T浓度的影响

抑郁大鼠4种激素在血清中浓度与对照组相比均显著降低，差异有统计学显著性(P<0.05)。光照后，微波硫灯组4种激素浓度明显升高，与对照组相比差异无统计学显著性，其它光照没有明显作用，见表3。

5不同光照对雌性抑郁大鼠卵巢和子宫脏器系数的影响

建模后抑郁大鼠的卵巢和子宫脏器系数与对照组相比明显降低，差异有统计学显著性(P<0.05)。4种光照后，卵巢脏器系数与对照组比明显降低(P<0.05)；子宫脏器系数与对照组间的差异无统计学显著性，见表4。

表3　各组大鼠血清中E2、 PRL、PROG及T的浓度

*P<0.05vscontrol group.

表4光照后各组大鼠卵巢和子宫的脏器系数

Table 4.The ovary index and uterus index of rats in each group

after lighting (%. Mean±SD.n=7)

GroupOvaryindexUterusindexControl0.188±0.1540.38±0.18Depressivemodel0.055±0.011*0.22±0.03*Sulfur0.059±0.010*0.32±0.07Heatradiation0.056±0.019*0.39±0.11Fluorescent0.067±0.008*0.34±0.15LED0.059±0.021*0.42±0.16

*P<0.05vscontrol group.

6不同光照对抑郁大鼠卵巢组织病理学的影响

图2可见，对照组卵巢组织致密，可见各期卵泡、卵丘，黄体发育正常，细胞形态完整、排列整齐、层次分明，未见充血水肿；抑郁模型组卵巢组织疏松，黄体体积膨大，组织间隙大量充血以髓质最为严重，细胞排列分散、胞核固缩且细胞间隙大量充血，未见细菌感染所致的炎症反应；微波硫灯组卵巢组织致密，可见不同时期卵泡及发育正常的黄体，细胞形态完整、排列整齐，未见明显充血水肿及炎症反应；热辐射组、日光灯组和LED组的卵巢组织疏松，黄体退化，组织不同程度的充血水肿，以热辐射组改变最明显。各组均未见细菌感染所致的炎症反应。

Figure 2.HE staining of ovarian tissues from the rats in each group (×100).

图2各组大鼠卵巢组织HE染色结果

讨论

临床研究表明，抑郁患者性激素分泌紊乱[10-11]，这在动物实验中也得到了一些证实。如抑郁大鼠的性激素水平全面降低[12]，同时抑郁是导致雌性大鼠动情周期紊乱的一个关键性因素[13-14]。我们得到了与这些学者相似的结果，在实验中观察到雌性抑郁大鼠动情周期紊乱；子宫和卵巢的脏器系数比降低，卵巢下降的程度更为明显，提示卵巢与子宫有萎缩现象，在此基础上部分卵巢伴随充血性病理学变化；血清中E2、T、PRL和PROG的浓度明显降低。这些结果都提示抑郁症大鼠伴随卵巢与子宫的结构与功能的病理性改变。

光照可以改善动物的生殖功能，如王秋菊等[15]发现增加自然光光照时间能提高母鹅血清卵泡刺激素、黄体生成素和PRL水平，并接近对照组鹅繁殖期的性激素水平，Mason等[16]发现短日照会抑制仓鼠的繁殖。光照可以调节下丘脑-垂体-性腺轴，从而调节生殖功能[17]，但是光照对抑郁大鼠的生殖功能的影响知之甚少。我们通过阴道涂片观察到光照后对阴道脱落细胞的形态没有明显的影响，但可调整动情周期。微波硫灯照射后抑郁大鼠的动情周期调整为4～6 d，基本接近对照组；热辐射灯组、日光灯和LED灯组尽管有一定的改善，但周期仍明显延长，约6～8 d。

卵巢是个复杂的内分泌器官，卵泡的发育、成熟、排卵、黄体的形成和退化不仅受下丘脑-腺垂体-卵巢轴的调节，也分泌不同的性激素来调节子宫内膜和阴道上皮细胞的周期性变化。大鼠的动情期包括，动情前期(相当于人类月经周期的卵泡期，卵泡快速生长)、动情期(相当于排卵期，卵泡发育成熟并排卵)、动情后期(相当于黄体期，黄体生成并逐渐成熟)和动情间期(相当于月经期，黄体退化并向卵泡期转换)，所以动情周期阴道上皮细胞的变化规律可以直接反映卵巢的功能和生殖功能。抑郁症大鼠动情期时间的紊乱、延长，提示其卵巢的功能可能较低，性激素的水平可能下调，而微波硫灯照射后抑郁大鼠动情周期的明显改善可能与改善大鼠的卵巢功能相关。因此，我们进一步检测了血清中雄激素和雌激素水平及卵巢的组织学改变，实验得到了与动情周期一致的变化结果，微波硫灯照射提高了抑郁大鼠的E2、PRL、PROG和T水平,明显降低卵巢的充血性病理改变；而暖光灯、日光灯和LED灯对雌性抑郁大鼠的生殖周期和性激素水平，以及卵巢组织病理学变化没有明显作用。

微波硫灯照射改善抑郁大鼠的生殖功能的机制可能与微波硫灯的特性及褪黑素有关。微波硫灯是模拟的人工小太阳，能够发射出类似太阳光的连续光谱，它包括了暖光灯、日光灯和LED灯等光谱能源范围，是人最适应也是最能够接受的光源，能够满足抑郁症患者对阳光的需要[18-19]。研究发现褪黑素是松果体等所分泌的光敏感激素，光照可以上调褪黑素的含量[20]，如外源性褪黑素可以逆转大鼠卵巢多囊样改变[21]。Lee等[22]应用RT-PCR及原位PCR技术检测到，MT受体MelR基因在出生后即刻就在卵巢颗粒细胞上表达，原始卵泡和闭锁卵泡上弱表达，系膜细胞上不表达。卵巢上有褪黑素高亲和力的受体[23]。这些研究都提示褪黑素在卵巢的发育与功能发挥上起着至关重要的作用。我们前期的实验也证明了微波硫灯照射后可以明显上调褪黑素，而暖光灯、日光灯和LED灯上调褪黑素作用不明显。所以我们认为微波硫灯照射后可能通过上调褪黑素，后者作用于卵巢上的褪黑素受体，改善卵巢功能，最终改善了抑郁大鼠的生殖功能。但是这些还需要后期的实验进一步证明。

在研究中我们还发现，尽管4种光照都可以改善子宫的脏器系数，但对卵巢的脏器系数作用不明显，这可能是与光照后功能的恢复比结构的恢复更快有关。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

神经肽脑活素疗法可改善阿尔茨海默病APP转基因模型中神经干细胞移植物的存活状况

神经干细胞(NSCs)已被证实在阿尔茨海默病(AD)的治疗上具有一定的潜力，但因其移植后的存活能力差而使它的应用受到阻碍。对移植的干细胞补给神经营养因子可以作为促进干细胞存活的一种方法。Rockenstein等研究了脑活素(Cerebro-lysin, CBL；一种具有神经营养作用的肽混合物)在APP转基因(tg)AD模型中辅助干细胞治疗的作用。对移植有小鼠NSCs的APP tg AD和非转基因(non-tg)小鼠均用CBL进行了干预，分别在1、3、6和9个月后取海马组织进行分析。相比non-tg小鼠，APP tg AD小鼠脑中NSCs存活数量较少；而CBL处理可以促进这2组小鼠脑中NSCs的存活，且大部分存活的NSCs维持神经母细胞的形态。经CBL处理的小鼠的NSCs表现为caspase-3阳性和TUNEL阳性细胞数目减少，而脑源性神经营养因子(BDNF)和弗林蛋白酶(furin)的免疫组化阳性增强。这些结果表明，CBL可能对移植的NSCs具有保护功能， 从而在NSCs移植治疗AD的过程中可能起到辅助作用。

Stem Cell Res, 2015, 15(1):54-67(黄翠芹)

Effects of different lighting on reproductive system in depressive female rats DI

Guan-teng, WANG Sha-li

(InstituteofNeuroscience,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:cqykdxwangshali@cqmu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of different lighting on the reproductive system in depressive female rats. METHODS: Healthy adult female rats were randomly chosen as control group, and the depressive adult female rats in SPF grade were randomly divided into 5 groups (7 rats each): depressive model group, sulfur lamp group, heat radiation lamp group, fluorescent lamp group and LED lamp group. After 45 d of continuous illumination, the estrous cycle was observed by the vaginal exfoliated cells, and the organ indexes of ovary and uterus were calculated. The concentrations of estiadrol (E2), prolactin (PRL), progesterone (PROG) and testosterone (T) in the serum were detected by ELISA, and the histopathological lesion of ovary was observed under microscope with HE staining. RESULTS: The estrous cycle exhibited serious disorder, the ovaries exhibited serious congestion, and the organ indexes of ovary and uterus and the concentrations of E2, PRL, PROG and T decreased significantly in the rats in depressive model group compared with control group (P<0.05). The estrous cycle and histopathological damage of ovary were obviously improved, and the concentrations of E2, PRL, PROG and T were significantly increased after the sulfur lamp lighting in the depressive female rats compared with depressive model group. No obvious change and improvement of the reproductive functions in the heat radiation lamp group, fluorescent lamp group and LED lamp group was observed. CONCLUSION: The reproductive functions of depressive female rats are improved by sulfur lamp lighting.

[KEY WORDS]Lighting; Depressive female rats; Reproduction; Sulfur lamp; Sex homone

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.020

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 023-68892728; E-mail: cqykdxwangshali@cqmu.edu.cn

[收稿日期]2015- 10- 12[修回日期] 2015- 12- 10

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0510- 06

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