ADD3可变剪接在结肠癌与正常组织间的差异表达*

陶　敏，　黄良祥，　蔡鹏威，　晋　龙，　吴文冰，　曾长青，　黄　毅，　伍严安

(福建医科大学省立临床医学院，福建省立医院, 福建 福州 350001)



ADD3可变剪接在结肠癌与正常组织间的差异表达*

陶敏，黄良祥，蔡鹏威，晋龙，吴文冰，曾长青，黄毅，伍严安△

(福建医科大学省立临床医学院，福建省立医院, 福建 福州 350001)

[摘要]目的： 探讨内收蛋白3(ADD3)及其剪接体与结直肠癌(CRC)的关系。方法: Real-time PCR方法检测50对CRC组织、20对结直肠息肉组织、经5-氟尿嘧啶(5-FU)或奥沙利铂干预前后的SW480(低转移性)和SW620(高转移性)结肠癌细胞中ADD3-、ADD3-Ia和ADD3-Ib 的表达量。用MTT检测细胞的活力，用划痕实验检测细胞的转移能力，用Transwell实验检测细胞的侵袭性。结果: CRC组织中ADD3与ADD3-Ib的表达量低于正常组织(P<0.01)，ADD3-Ia/Ib 比值高于正常组织(P<0.01)；病理分组发现ADD3-Ia在T3-4组的表达量较T1-2组高(P<0.05)。结直肠息肉组织中ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib的表达量低于正常组织(P<0.01)。SW620细胞中ADD3-Ia和ADD3-Ib的表达量低于SW480细胞(P<0.05), ADD3-Ia/Ib比值高于SW480(P<0.01)；在经奥沙利铂和5-FU分别处理后，在SW620和SW480细胞活力、迁移和侵袭能力减弱，而ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib的表达量均有不同程度增高。结论: CRC中ADD3-Ib和ADD3减少，并伴随ADD3-Ia/Ib比值升高。ADD3及其剪接体的改变可能跟CRC的侵袭能力有关。

[关键词]ADD3； 结直肠癌； 可变剪接； 细胞侵袭

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一，死亡率在世界上排名第3位，在我国排名第5位，每年约有608万人死于CRC[1]。CRC发生发展的病理机制十分复杂，目前认为基因突变是癌变过程中最早涉及的初级遗传事件，而在CRC发展过程中将会引发次级分子事件，即基因表达改变，如差异性表达、可变剪接与融合基因。近几年，一些基因表达的可变剪接体与肿瘤的关系受到重视，内收蛋白3(adducin 3，ADD3)可变剪接体就是其中的一个。已有报道ADD3可变剪接的表达差异跟非小细胞肺癌[2]及小鼠乳腺癌细胞[3]有关，本研究组在前期工作中发现一例CRC患者的ADD3可变剪接在CRC与正常组织的表达存在差异[4]，这些均引起我们进一步探讨ADD3可变剪接体与CRC关系的兴趣。

ADD3的基因定位于染色体10q24.2-24.3，含15个外显子。ADD3是1986年Gardner等在红细胞中发现的一种细胞膜骨架蛋白，其有参与细胞膜骨架网状结构构建和维持、细胞信号转导、细胞膜离子转运等多项生理功能[5]。由于启动子选择和剪接方式不同，ADD3基因产生3种mRNA差异剪接体，即变体1(variant 1)、变体2(variant 2)，和变体3(variant 3)，表达2种蛋白：ADD3亚型a(isoform a,Ia)，由变体1翻译，表达第14号外显子；ADD3亚型b(isoform b,Ib)，由变体2和变体3翻译，第14号外显子表达缺失。本研究探讨CRC中总ADD3的mRNA、ADD3亚型a(ADD3-Ia)和ADD3亚型b(ADD3-Ib)mRNA的变化及其意义。

材料和方法

1组织和细胞

1.1CRC和息肉组织在知情同意的情况下收集2012年9月～2013年6月于本院胃肠外科及肿瘤外科手术的50例CRC患者的癌组织及距离癌灶边缘>5 cm的上游正常黏膜组成配对样本，其中结肠癌25例，直肠癌25例。20例息肉患者在肠镜下取出的息肉组织及距离息肉边缘>5 cm的上游正常黏膜组成配对样本。结肠息肉18例，直肠息肉2例。结直肠息肉多数为1～2个，少数为3～4个散在多发息肉，直径0.3 cm～1 cm，未见家族性腺瘤性息肉病表现，均无家族性腺瘤性息肉病家族史。所有样本均在20 min内切下即放入RNA保存液，-80 ℃保存至检测。所有病例术前均未接受化疗，放疗及生物治疗、所有标本均经病理学检查证实。

1.2结直肠癌细胞株采用国内外通用，来自同一亲本，遗传背景一致的人大肠癌高转移性细胞株 SW620 和低转移性细胞株 SW480[6]。SW480购自中科院上海细胞研究所，SW620由福建省肿瘤医院研究室赠予。

2主要试剂

RNA保存液、TRIzon总RNA提取试剂和GoldStar TaqMan Mixture(with ROX)购自北京康为世纪生物科技有限公司；RevertAidTM第一链cDNA 合成试剂盒购自Thermo；不完全L-15培养基购自南京凯基生物科技发展有限公司；胎牛血清购自天津灏洋生物制品有限公司；胰酶购自Gibco；MTT购自Amresco。Transwell 24孔板和Matrigel基质胶购自Corning。所用引物和探针由上海英潍捷基公司合成，序列见表1。

表1　引物和探针序列

3主要方法

3.1细胞培养细胞置于含10%胎牛血清不完全L-15培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，2～3 d换液 1 次，实验用细胞为状态良好的对数生长期细胞。

3.2MTT比色法检测细胞活力将SW620和SW480细胞接种于96孔培养板，每孔100 μL，每孔接种细胞数为2×103，每组设3个复孔，培养24 h；吸弃孔中培养基，加入100 μL 含有浓度为0 mg/L、0.05 mg/L、0.5 mg/L和5 mg/L的奥沙利铂培养液或浓度为0 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L和100 mg/L的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU) 的培养液培养24 h，加入5 g/L的MTT 10 μL，37 ℃孵育4 h后小心吸去上清，加入150 μL二甲基亚砜，振荡溶解结晶后用490 nm波长比色，评价细胞存活率。实验重复3次。

3.3划痕实验检测细胞迁移能力取对数生长期的细胞按每孔5×105加入12孔板，90%融合后，用10 μL无菌枪头均匀划痕，PBS洗3次，更换为含2%胎牛血清的培养基，分组加入不同药物。37℃、 5% CO2培养箱培养，24 h后观察划痕愈合情况并拍照。每组实验重复3次。

3.4Transwell实验用无血清培养基1∶9稀释基质胶，吸50 μL均匀铺于Transwell上室。分组加入不同药物，用无血清培养基调整细胞密度为5×108/L；取100 μL细胞悬液加入上室，下室加600 μL 10%胎牛血清培养基，37 ℃、5% CO2培养24 h。取出小室，4%多聚甲醛固定后加0.1%结晶紫染色，PBS洗2次，用棉签小心擦去上室细胞，倒置显微镜下随机选取5个视野计数细胞并拍照(×200)。每组实验重复3次。

3.5药物干预将细胞接种于6孔培养板，每孔2 mL，细胞密度为5×108/L，每组设3个复孔，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养24 h，细胞贴壁后吸弃培养液，加入不含血清的培养液2 mL，饥饿培养24 h后分别换用含有浓度为0 mg/L、0.05 mg/L、0.5 mg/L和5 mg/L的奥沙利铂培养液及浓度为0 mg/L、0.01 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L和100 mg/L的5-FU的培养液2 mL，24 h后用TRIzon试剂收集各孔细胞。实验重复3次。

3.6Real-time PCR将收集的细胞和组织按照TRIzon总RNA提取试剂的操作说明书进行总RNA的提取，紫外分光光度计比色后选用A260/A280在1.8～2.0的标本1 μg逆转录成cDNA。取50 ng cDNA进行real-time PCR：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃60 s，扩增40个循环。

4统计学处理

采用国际通用的real-time PCR相对定量2-ΔΔCt方法[7]表示ADD3、ADD3-Ia、ADD3-Ib和ADD3-Ia/Ib的相对表达水平。实验数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间均值的比较采用t检验，病理分析运用非参数Mann-WhitneyU检验，各用药细胞组内比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD-t法行各组间均数的两两比较。所有统计学处理均在SPSS 17.0统计软件包上进行。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1CRC组织的ADD3表达量比较

CRC中ADD3的表达量低于正常组织(P<0.01)，50例中表达量低者有37例(74%)；ADD3-Ia表达量较正常黏膜组织无显著改变；ADD3-Ib表达量低于正常组织(P<0.01)，50例中表达量低者有42例(84%)；ADD3-Ia/Ib的比值高于正常组织(P<0.01)，见图1。

Figure 1.The mRNA expression of ADD3 in the CRC. Mean±SD.n=50.**P<0.01vsnormal.

图1CRC组织ADD3及各亚型的mRNA表达量

2CRC组织的病理分析

将50对CRC组织(病理图片见图2)根据美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟结直肠癌TNM分期(第7版)划分深度(T1组1例，T2组12例，T3组3例，T4组34例)，比较后发现ADD3-Ia的表达量在T3-4组中为2.119±1.246，显著高于T1-2组的1.081±0.405(P<0.05),见图3。

Figure 2.The pathological images of the CRC and colorectal polyp tissues (HE staining).

图2CRC病理组织和息肉组织的形态学观察

Figure 3.The mRNA expression of ADD3-Ia in T1-2 and T3-4 groups. Mean±SD.n=10～37.*P<0.05vsT1-2 group.

图3ADD3-Ia mRNA在病理分组T1-2和T3-4中的表达量

2结直肠息肉组织ADD3表达量的比较

ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib表达量在结直肠息肉组织(病理图片见图2)中分别为1.050±0.806、1.105±0.486和1.130±0.615，均低于正常组织(P<0.01)；ADD3-Ia/Ib各组间差异无统计学显著性，见图4。

Figure 4.The mRNA expression of ADD3 in the colorectal polyps. Mean±SD.n=20.**P<0.01vsnormal.

图4结直肠息肉 ADD3的mRNA表达量比较

3SW620细胞和SW480细胞中ADD3的表达差异

SW620细胞中ADD3的表达量与SW480细胞比较差异无统计学显著性(P>0.05)；SW620细胞中ADD3-Ia和ADD3-Ib的表达量低于SW480(P<0.05)，ADD3-Ia/Ib比值高于SW480细胞(P<0.01)，见图5。

4MTT实验结果

经不同剂量奥沙利铂和5-FU分别处理24 h后SW620细胞和SW480细胞的生存率均受到不同程度抑制，见图6。

Figure 5.The mRNA expression of ADD3 in SW480 cells and SW620 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsSW480.

图5ADD3 mRNA在 SW480细胞和SW620细胞中的表达量比较

Figure 6.The effect of oxaliplatin or 5-FU on the survival of SW620 and SW480 cells detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L.

图6经奥沙利铂或5-FU处理后SW620细胞和SW480细胞存活率的比较

5划痕实验结果

经奥沙利铂和5-FU分别处理后，细胞愈合速度明显慢于各自对照组细胞，表明加药后SW480细胞和SW620细胞的迁移速度减慢，见图7。

6Transwell实验结果

经奥沙利铂和5-FU分别处理后，细胞穿膜数明显少于各自对照组细胞，表明5-FU和奥沙利铂作用后SW480细胞和SW620细胞的侵袭能力降低，见图8。

7药物干预实验

SW480细胞和SW620细胞经不同浓度奥沙利铂和5-FU分别处理后，ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib的mRNA表达量均有不同程度升高。但是在5-FU达到10 mg/L、100 mg/L的较大浓度时，ADD3 各指标表达量下降，见图9、10。

Figure 7.The wound-healing assay of SW480 cells and SW620 cells (×100). It showed that the cell migration was inhibited by oxaliplatin or 5-FU.

图7SW480细胞和SW620细胞的划痕实验

讨论

真核生物中，成熟的mRNA是由初始转录产物前mRNA(pre-mRNA)经过剪接过程产生。一种pre-mRNA具有多种剪接程序，从而形成不同的mRNA。异常剪接、剪接过程改变，甚至某一特定可变剪接的转换，都可能在肿瘤发生、发展的某一阶段起到重要作用。有研究表明可变剪接产生蛋白质亚型的比例的改变可引发疾病[8]。

Kwong等[2]对非小细胞肺癌组织的研究发现：相对于正常组织，ADD3剪接体中缺失第14号外显子的剪接体(在本研究中即ADD3-Ib)在非小细胞肺癌中表达减低。Bisognin等[9]对46例CRC组织，23例正常结直肠黏膜组织和27例肝转移的可变剪接研究中，发现某些肿瘤特异性的可变剪接常见于结直肠癌早期，可变剪接在正常组织和癌症的早期含量丰富，到了肝转移时大幅下跌。Rani等[10]的研究发现微小RNA-145(miR-145)通过调节蛋白Sox9和细胞黏附分子ADD3的活性来行使其肿瘤抑制作用从而减少人类胶质细胞瘤的增殖、黏附和侵袭能力。

Figure 8.The images of the cell invasion assay (×200). It showed that the invasion abilities of SW480 cells and SW620 cells were inhibited by oxaliplatin or 5-FU.

图8细胞侵袭性实验

Figure 9.The effect of oxaliplatin on the mRNA expression of ADD3 in SW480 cells and SW620 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L.

图9经奥沙利铂处理后SW480细胞和SW620细胞ADD3的mRNA 表达量

Figure 10.The effect of 5-FU on the mRNA expression of ADD3 in SW480 cells and SW620 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg/L.

图10经5-FU铂处理后SW480细胞和SW620细胞ADD3的mRNA 表达量

结合本研究结果提示了ADD3的表达减低可能跟细胞的侵袭和迁移功能有关。

本课题组前期研究结果发现，ADD3-Ib在1例CRC患者癌组织中表达量增加。本次研究中我们发现ADD3-Ia和ADD3-Ib两种剪接体在正常组织和肿瘤组织中均有表达，但表达量有显著差异。ADD3的表达量包括ADD3-Ia和ADD3-Ib，ADD3-Ia的表达量较正常组织无显著差异，而ADD3-Ib和ADD3在CRC组织中表达量显著低于正常组织，说明ADD3在CRC组织中的表达量低于正常组织可能主要是与ADD3-Ib的显著减少有关，伴随着ADD3-Ia/Ib的比值显著升高。

结直肠息肉组织中也存在ADD3和ADD3-Ib表达量较正常组织低的现象，这可能表示ADD3及其剪接体的表达量在良性组织中也发生了变化，与CRC不同的是ADD3-Ia在息肉组织中表达量明显低于正常组织，ADD3-Ia/Ib比值较正常组织无显著差异。可见ADD3及其剪接体的表达差异在结肠癌与息肉组织中存在差异。相比较于息肉，CRC中ADD3-Ia表达量上调，导致ADD3-Ia/Ib的比值显著升高。经病理分组分析后发现临床分期更晚的T3～4组中ADD3-Ia的表达量高于临床分期早的T1～2组。

在细胞实验部分，从ATCC细胞库中选择高转移性SW620和低转移性SW480作为受试细胞株。检测发现2株细胞的表达量存在明显差异，这个结果提示了ADD3及其剪接体的改变可能与CRC的转移性有关。用不同浓度奥沙利铂和5-FU干预细胞，细胞划痕实验和侵袭性实验发现细胞迁移能力和侵袭能力均受到抑制，同时ADD3、ADD3-Ia和ADD3-Ib的表达量均有不同程度升高，从另一个角度验证了ADD3及其剪接体表达量的升高与结直肠癌细胞株迁移和侵袭能力下降相关。

综上所述，本研究结果提示，在CRC中ADD3可变剪接体的表达发生了改变，ADD3-Ia/Ib比值的升高可能是 ADD3可变剪接在CRC中的特征性表现，并可能与CRC的侵袭能力有关。下一步值得进行的工作是探讨其是否可能成为一种CRC标志物,以及反映CRC侵袭性的标志物。这一比值在CRC中的变化与肿瘤的因果关系尚不明确，亦需要进一步的研究。

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[5]Gardner K, Bennett V. A new erythrocyte membrane-associated protein with calmodulin binding activity. Identification and purification[J]. J Biol Chem, 1986, 261(3):1339-1348.

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[10]Rani SB, Rathod SS, Karthik S, et al. MiR-145 functions as a tumor-suppressive RNA by targeting Sox9 and adducin 3 in human glioma cells[J]. Neuro Oncol, 2013, 15(10):1302-1316.

(责任编辑： 林白霜， 罗森)

Differential expression of ADD3 splicing isoforms between colorectal cancer and normal mucosa tissues

TAO Min, HUANG Liang-xiang, CAI Peng-wei, JIN Long, WU Wen-bing, ZENG Chang-qing, HUANG Yi, WU Yan-an

(FujianProvincialHospital,ProvincialClinicalCollege,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China.E-mail:wyaslyy@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the relationship between the expression of adducin 3 (ADD3) and its splicing isoforms and colorectal cancer (CRC). METHODS: The expression of ADD3, ADD3-Ia and ADD3-Ib in 50 pair of CRC tissues, 20 pairs of colorectal polyp tissues, and 2 CRC cell lines SW480 and SW620 before and after oxaliplatin or fluorouracil intervention were detected by real-time PCR. The cell activity was determined by MTT assay, the cell migration ability was evaluated by wound-healing assay, and the cell invasion ability was measured by Transwell assay. RESULTS: The expression levels of ADD3 and ADD3-Ib were decreased in the CRC tissues as compared with the normal mucous (P<0.01), and ADD3-Ia/Ib ratio was increased in the CRC tissues (P<0.01). The expression level of ADD3-Ia was higher in T3-4 group than that in T1-2 group (P<0.05). Reduced expression of ADD3, ADD3-Ia and ADD3-Ib in colorectal polyps was observed compared with the normal tissues (P<0.01). Compared with the SW480 cells, the expression levels of ADD3-Ia and ADD3-Ib were lower (P<0.05) and the ADD3-Ia/Ib ratio was higher (P <0.01) in the SW620 cells. After treated with oxaliplatin or fluorouracil, the cell activity, migration and invasion in the SW620 and SW480 cells were weakened accompanied by the increases in the expression levels of ADD3, ADD3-Ia and ADD3-Ib to various certain extents. CONCLUSION: In CRC there is a tendency that ADD3-Ib reduction leads to ADD3 decrease, accompanied by an increased ADD3-Ia/Ib ratio. The expression changes of ADD3 and its splicing isoforms in the CRC may be relevant to its invasion ability.

[KEY WORDS]ADD3; Colorectal cancer; Alternative splicing; Cell invasion

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.011

[中图分类号]R730.23; R735.3

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 0591-88217897; E-mail: wyaslyy@126.com

*[基金项目]福建省卫生计生委创新课题(No. 2012-CXB-6)

[收稿日期]2015- 07- 15[修回日期] 2015- 12- 28

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0451- 07

杂志网址： http://www.cjpp.net