PLTP在香烟诱导A549细胞合成白介素8中的作用①

余秀英　陈亚娟　巫凤苹　邹琳琳　陈雨晗　黎友伦

(重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆400016)



PLTP在香烟诱导A549细胞合成白介素8中的作用①

余秀英陈亚娟巫凤苹邹琳琳陈雨晗黎友伦

(重庆医科大学附属第一医院呼吸内科，重庆400016)

[摘要]目的：研究磷脂转运蛋白(Phospholipid transfer protein，PLTP)对香烟诱导人肺泡上皮A549细胞合成白介素8(Interleukin-8，IL-8)的影响。方法：体外培养人肺泡上皮A549细胞株24 h，加入不同浓度的烟草提取物(Cigarette smoking extracts,CSE)共培养24 h；1.0% CSE与A549细胞株共培养6、12、24、48 h；PLTP siRNA预处理后，加入CSE共培养24 h。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测A549细胞增殖情况；实时定量PCR(RT-PCR)检测PLTP和IL-8 mRNA的表达量；蛋白质印迹法(Western blot)检测PLTP的表达量;酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)检测IL-8相对含量。结果：0.125%烟草提取物促进A549细胞增殖，0.25%、0.5%、1.0% CSE浓度对A549细胞生长无明显影响，而2.0%、4.0% CSE浓度抑制A549细胞增殖；不同浓度的(0.25%、0.5%、1.0%)CSE作用24 h后，PLTP和IL-8 mRNA及蛋白表达量增加,并且IL-8蛋白分泌呈现一定时间依赖性；PLTP siRNA处理后，IL-8表达量明显升高(P<0.001)。结论：PLTP基因缺失促进香烟诱导A549细胞合成IL-8。

[关键词]烟草烟雾提取物；人肺泡上皮细胞；A549;PLTP;IL-8

吸烟可以导致肺气道损伤，引起肺部严重疾患。香烟中的固有成分及在燃烧所产生的有毒物质可以引起肺部的炎症反应。调查研究显示香烟烟雾暴露是导致肺损伤的一项重要危险因素[1]。研究表明，IL-8是烟雾吸入造成的肺损伤反应中的重要介质[2]。 Aggarwal等[3]证实,中性粒细胞激活在肺损伤的发病机制中起着关键性的作用,而IL- 8是中性粒细胞肺部浸润的最主要的趋化因子。肺上皮细胞是炎症趋化因子IL-8的重要来源[4]，IL-8趋化和激活炎症细胞，如中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞,而这些活化的炎症细胞又能进一步促进IL-8分泌。

PLTP是一类存在于包括人类和许多动物血浆中的促进血浆脂蛋白间、脂蛋白与细胞间脂质及其相关物质转运和交换的特殊蛋白。大量研究表明，PLTP在脂类代谢、免疫调节以及神经变性疾病等起着非常重要的作用，尤其是脂类代谢[5-7]。而PLTP在肺病疾病中的作用尚不十分明确，相关研究更是凤毛麟角。文献报道，正常人类和鼠肺组织是PLTP mRNA表达最为丰富的器官[8]，并且Brehm等[9]研究发现吸烟可以上调肺组织PLTP的表达活性，我们的前期研究也证实[10]，氧化低密度脂蛋白和烟草提取物可以刺激肺Ⅱ型上皮细胞合成PLTP,因此，本文利用肺上皮细胞特异性基因敲除的方法研究PLTP在香烟烟雾诱导A549细胞合成IL-8中的作用，以进一步探讨PLTP参与肺损伤的发病机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药物、试剂和仪器高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于Thermo公司，SDS-PAGE 凝胶配置试剂盒购自碧云天生物技术研究所；PLTP抗体购于美国Abcam公司，GAPDH抗体以及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购于Santa公司；IL-8 ELISA KIT购自博士德公司；RNAiso Plus试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green Supermix均购自TaKaRa公司，PLTP siRNA(sense：5-GAGCUGCAACUGA-CAUCUUTT-3；antisense:5-AAGAUGUCAGUUGC-AGCUCTG-3)购自吉玛基因，其余均为国产试剂。CO2恒温培养箱，美国Thermo Scientific公司；超低温冰箱，美国Revco公司；高速台式离心机，美国Sigma公司；纯水仪，美国Milipore公司；M450酶标仪，实时定量PCR仪，美国Bio-Rad公司； PAC3000型电泳仪、电转仪，北京六一公司。

1.1.2细胞株来源及培养人肺Ⅱ型上皮细胞(A549)源自重庆医科大学分子医学与肿瘤实验室，用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基，于37℃,5%CO2及饱和湿度条件下常规培养，每2～3 d传代1次，所有实验均在细胞对数生长期进行。

1.2方法

1.2.1烟草烟雾提取物的制备宏升牌香烟购自重庆烟草公司，每只烟含焦油11 mg，一氧化碳17 mg，尼古丁1.1 mg。根据Wirtz[11]文献中提及的烟草烟雾提取物制备方法进行操作。操作步骤如下所述：点燃一只香烟，去除滤嘴，安放在抽吸装置上。匀速地抽吸，使烟雾通过一个装有10 ml无血清的DMEM培养基的玻璃瓶，此时可见烟草烟雾通过DMEM培养基并产生大小均匀的气泡，收集瓶中出现大量烟雾，且保证每支香烟燃烧约4 min。当10支香烟燃烧产生的烟雾通过该培养基后，停止抽吸。调节香烟烟雾-DMEM培养基混合物的pH至7.4，并用0.22 μm的过滤器除去杂质和细菌，即为烟草烟雾提取物。使用Beckman DU 640 分光计(Fullerton,CA,USA)测定烟草烟雾提取物在320 nm处的吸光度值，约为1.36±0.12，将此时对应的CSE浓度设为100%。实验时，根据实验需要将100%烟草烟雾提取物稀释至所需浓度即可。CSE最好现配现用，尽量在制备好30 min内使用。

1.2.2MTT法检测CSE对A549细胞增殖的影响将约2×103/0.2 ml细胞种植在96孔板内，培养24 h，然后加入相应浓度的CSE继续培养24 h后，吸尽孔板内的培养液，用PBS清洗两次后再在每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT混匀，在37℃、5%CO2培养4 h，吸干每孔内的上清，每孔加入DMSO 150 μl震荡使沉淀充分溶解，酶标仪570nm波长测定OD值。

1.2.3RT-PCR检测IL-8 mRNA的表达取处于对数生长期的人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549以2×105ml-1的密度接种于六孔板中，分别设置对照组和实验组，常规培养24 h后实验组分别加入终浓度为0.25%、0.5%、1.0%的CSE，处理24 h后收集细胞，采用Trizol法分别提取各细胞内的总RNA，经核酸浓度测定仪(Fullerton,CA,USA)测定RNA的浓度，并且样品A260/280比值均介于1.8～2.0。使用TaKaRa逆转录试剂盒采用两步法将样品逆转为cDNA，然后在PCR仪(Bio-Rad,USA)上进行实时定量PCR测定IL-8 mRNA的表达量。

1.2.4Western blot检测PLTP、GAPDH蛋白的表达取处于对数生长期的人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549以2×105ml-1的密度接种于六孔板中，分别设置对照组和实验组，常规培养24 h后实验组分别加入终浓度为0.25%、0.5%、1.0%的CSE，处理24 h，收集上清液并4℃，3 000 r/min离心15 min后收集上清液于-80℃中保存。收集细胞用细胞裂解液于冰上同时裂解各组细胞30 min，12 000 r/min离心10 min，提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量。运用酶标仪测定各组蛋白质含量并配平，使各组蛋白终浓度一致。每个点样孔加样60 μg蛋白样品液，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。凝胶上的蛋白转到0.45 μm的PVDF膜，5%的脱脂牛奶封闭膜上的蛋白结合位点2 h。采用兔抗人PLTP(1∶3 000),兔抗人内参GAPDH多抗(1∶1 000),4℃孵育过夜。用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分别加入辣根过氧化物标记的山羊抗兔IgG(1∶1 000)常温孵育2.0 h。TBST溶液漂洗,用ECL试剂发光，曝光。图像扫描后运用图像分析软件Quantity One分析条带的吸光度值，对照组和实验组目的条带的灰度值和内参的吸光度值比值表示蛋白质相对表达水平。

1.2.5ELISA法测定IL-8相对含量将收集的上清液稀释三倍之后按每孔100 μl加入事先准备好的ELISA试剂盒孔板中37℃孵育90 min，弃液后每孔加入生物素抗人IL-8抗体工作液100 μl 37℃反应60 min，用PBS洗涤3次后每孔加入ABC工作液100 μl 37℃反应30 min，再次用PBS洗涤5次后每孔按90 μl依次加入TMB显色液，37℃避光反应30 min后每孔加入100 μl TMB终止液。用酶标仪在450 nm测定OD值。根据所测OD做作出标准曲线，然后计算IL-8蛋白表达量。

1.2.6阳离子脂质体法转染siRNA取处于对数生长期的人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549以2×105ml-1的密度接种于六孔板中，分别设置阴性对照组和实验组常规培养16～24 h，细胞贴壁50%左右时，准备转染；DEPC消毒的去酶EP管中加入250 μl Opti-MEM培养液及5 μl RNAiMAX转染试剂，混匀，室温孵育5 min，另取DEPC消毒的去酶EP管加入250 μl Opti-MEM培养液及60 pmol的siRNA,混匀;吸取孔板中的完全培养基，以PBS冲洗细胞2次，吸取PBS,每孔加入不含胎牛血清和青、链霉素的DMEM培养基，总体积为2 ml；5 min之后将RNAiMAX混合试剂和siRNA混合试剂混合，混匀，室温静置20 min后按照分组加入孔板中；37℃孵育6 h后，吸取培养基，加入完全培养基孵育18～24 h后，再将A549细胞设置为NC siRNA处理组、CSE+NC siRNA处理组、siPLTP处理组、CSE+siPLTP处理组处理24 h之后收取上清液用ELISA法测定IL-8相对含量，提取各组细胞RNA以及总蛋白，分别用RT-PCR测定PLTP、IL-8 mRNA的表达情况以及用Western blot检测PLTP蛋白的表达量。

2结果

2.1烟草烟雾提取物对人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549合成IL-8的影响如图1A所示，经不同浓度(0.125%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%)的烟草烟雾提取物作用于A549细胞，采用MTT法，测烟草提取物对A549细胞增殖情况的影响，我们发现0.125%浓度的烟草提取物可以促进A549细胞增殖，0.25%、0.5%、1.0%浓度对细胞增殖无明显影响，而2.0%和4.0%浓度的烟草提取物可以明显抑制A549细胞增殖并且促进其死亡；如图1B～D所示，经不同浓度(0.25%、0.5%、1.0%)和不同时间(6、12、24、48 h)的烟草烟雾提取物作用于A549细胞，IL-8表达随着烟草浓度的增加而增加，并且在24 h分泌达到明显升高，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，烟草烟雾提取物能够刺激A549细胞合成和分泌IL-8，并且呈现浓度依赖性和一定的时间依赖性。

2.2烟草烟雾提取物对人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549合成PLTP的影响如图2所示，经不同浓度的烟草烟雾提取物作用于A549细胞24 h，PLTP的表达随着烟草浓度升高而增加，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明，烟草烟雾提取物能够刺激A549细胞合成PLTP,而PLTP与IL-8是否存在内在联系，尚需论证。

2.3PLTP转染效率以及在正常情况下和烟草烟雾刺激下其对IL-8 mRNA表达的影响如图3所示，PLTP siRNA转染稳定48 h ，PLTP siRNA的基因沉默率达到70%，并且观察到PLTP基因沉默之后，IL-8 mRNA的表达反而升高，并且PLTP siRNA沉默之后促进烟草提取物刺激A549细胞IL-8 mRNA的表达。

2.4PLTP基因沉默对烟草烟雾提取物诱导的人肺泡Ⅱ型上皮细胞A549 PLTP以及IL-8蛋白表达的影响如图4所示，1%的烟草提取物浓度作为工作浓度，PLTP siRNA预处理后，加入烟草提取物共培养24 h ，PLTP基因沉默之后可以促进基础以及烟草提取物刺激后IL-8蛋白的释放。

图1　烟草提取物对A549细胞释放IL-8的影响Fig.1　Effects of CSE on expression of IL-8 in A549 cellsNote: A,B,D.Different concentrations of CSE group vs control group,*.P<0.05,**.P<0.01，***.P<0.001；C.6 h，12 h，24 h and 48 h groups vs 0 h group,**.P<0.01;***.P<0.001.

图2　WB检测不同浓度烟草提取物对PLTP蛋白水平影响Fig.2　Protein expression of PLTP detected by WesternblotNote: Different concentrations of CSE groups vs control group，*.P<0.05；**.P<0.01.

图3　RT-PCR检测转染效率Fig.3　Infection efficiency detected by RT-PCRNote: A.Infection efficiency of A549 cells by RT-PCR;B.PLTP mRNA and IL-8 mRNA expression detected by PT-PCR.PLTP siRNA group vs NC siRNA group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001;PLTP siRNA+CSE group vs NC siRNA+CSE group,###.P<0.001.

图4　PLTP及IL-8蛋白表达情况Fig.4　Protein expression of PLTP and IL-8 in each groupsNote: A.Protein expression of PLTP detected by Western blot;B.Protein expression of IL-8 detected by ELISA.PLTP siRNA group vs NC siRNA group,**.P<0.01;PLTP siRNA+CSE group vs NC siRNA+CSE group,###.P<0.001.

3讨论

烟草烟雾中含有大量自由基(ROS)和有毒物质，吸入人体可导致细胞癌变、气道损伤以及肺部炎症。有研究报道[12，13]，不管是小鼠吸烟模型还是细胞离体实验中，IL-8表达升高幅度均比其他炎症因子高。并且IL-8在烟草烟雾导致的肺损伤中起着重要作用，它可以趋化和激活中性粒细胞，导致其在肺部的浸润。Modelska等[14]均研究发现,抗IL-8预处理可阻断中性粒细胞的肺部浸润,显著降低盐酸、内毒素等对血管内皮和肺泡上皮细胞的损伤。

PLTP是一类存在于包括人类和许多动物血浆中的促进血浆脂蛋白间、脂蛋白与细胞间脂质及其相关物质转运和交换的特殊蛋白。其在生命活动中起着重要作用，其水平及活性与多种炎症性疾病相关，比如动脉粥样硬化、糖尿病、神经炎症等[7,15,16]，但是至今尚未有研究PLTP在烟草烟雾引起的肺损伤中的作用报道。我们研究的目的主要是探索吸烟引起的肺损伤与PLTP的关系。考虑到香烟成分复杂，而烟草对肺部的影响并非单一物质而是成千上万的有毒物质，所以我们利用香烟而不是某种单体成分来研究吸烟对炎症反应的影响。我们的研究发现，在离体细胞实验中，PLTP以及IL-8的表达量具有烟草浓度依赖性，随着烟草浓度的增加，合成的PLTP和IL-8的量也在不断增加(如图1B、D,图2所示)。而通过PLTP基因沉默发现IL-8不管是在基础水平还是在烟草烟雾诱导情况下均显著升高(如图3、图4所示),表明PLTP在一定程度下可以抑制IL-8的合成。PLTP在烟草烟雾刺激下细胞内合成增加，这与Brehm等[9]的研究结果一致。但是我们的研究结果表明PLTP具有抗炎作用，那么烟草烟雾诱导的急性炎症反应IL-8明显升高，PLTP也呈现出增高趋势,这是否背道而驰？有研究报道[17]，在严重的内毒素血症小鼠模型中，与野生型小鼠相比，PLTP-/-小鼠的血浆以及组织中炎症因子水平更高，将其分离得到的脾细胞暴露于脂多糖(LPS)中，其炎症反应比野生型的更为剧烈，并且脾细胞死亡率也显著升高。而在临床研究中表明，病人细菌感染以及发生全身性炎症时PLTP活性升高，这也许是机体自我保护的重要代偿机制[18,19]；而Brehm等[9]的研究结果表明，PLTP在肺泡灌洗液中的活性下降。上述两个方面的原因可能是细胞内合成PLTP增加的原因。然而，在Schlitt等[20]的研究却发现，在动脉粥样硬化小鼠模型中，PLTP-/-小鼠通过下调白介素6(IL-6)达到抗炎作用，这与Gautier等[17]的研究结果以及我们的实验结果相反，可能原因有二，其一是模型的不同，再者就是所测的炎症因子不同，提示PLTP在调节炎症介质表达中作用机制复杂，有待进一步深入研究。

综上所述，我们证实PLTP基因沉默后可以使香烟诱导A549细胞合成和释炎症因子IL-8增加，说明PLTP基因具有一定的抗炎作用。通过此实验，可以为研究烟草烟雾所致的肺部急性炎症疾病致病机制提供思路和参考。

参考文献：

[1]Ando K,Doi T,Kaneko N,etal.The effect of comorbidity on the prognosis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome[J].Intern Med,2012,51(14):1835-1840.

[2]Pugin J,Verghesc G,Widmer MC,etal.The alveolar space is the site of in-tense inflammatory and profibrotic reactions in the early phase of acute respiratory distress syndrome[J].Crit Care Med,1999,27(2):304-312.

[3]Aggarwal A,Baker CS,Evans TW,etal.G-CSF and IL-8 but not GM-CSF correlate with severity of pulmonary neutrophilia in acute respiratory distress syndrome[J].Eur Respir J,2000,15(5):895-901.

[4]Mortaz E,Henricks PA,Kraneveld AD,etal.Cigarette smoke induces the release of CXCL-8 from human bronchial epithelial cells via TLRs and induction of the inflammasome[J].Biochim Biophys Acta,2011,1812(9):1104-1110.

[5]Albers JJ,Vuletic S,Cheung MC.Role of plasma phospholipid transfer protein in lipid and lipoprotein metabolism[J].Biochim Biophys Acta,2012,1821(3):345-357.

[6]Vuletic S,Dong W,Wolfbauer G,etal.PLTP regulates STAT3 and NF-kB in differentiated THP1 cells and human monocyte-derived macrophages[J].Biochim Biophys Acta,2011,1813(10):1917-1924.

[7]Vuletic S,Peskind ER,Marcovina SM,etal.Reduced CSF PLTP activity in Alzheimer′s disease and other neurologic diseases:PLTP induces apoE secretion in primary human astrocytes in vitro[J].Neurosci Res,2005,80(3):406-413.

[8]Jiang XC,D′Armiento J,Mallampalli RK,etal.Expression of plasma phospholipid transfer protein mRNA in normal and emphysematous lungs and regulation by hypoxia[J].J Biol Chem,2008,273(25):15714-15718.

[9]Brehm A,Geraghty P,Campos M,etal.Cathepsin G degradation of phospholipid transfer protein(PLTP)augments pulmonary inflammation[J].FASEB J,2014,28(5):2318-2331.

[10]Guo LL,Chen YJ,Wang T,etal.Ox-LDL-induced TGF-β1 production in human alveolar epithelial cells:involvement of the Ras/ERK/PLTP pathway[J].J Cell Physiol,2012,227(9):3185-3191.

[11]Wirtz HR,Schmidt M.Acute influence of cigarette smoke on secretion of pulmonary surfactant in rat alveolar type II cells in culture[J].Eur Respir J,1996,9(1):24-32.

[12]Tang GJ,Wang HY,Wang JY,etal.Novel role of AMP-activated protein kinase signaling in cigarette smoke induction of IL-8 in human lung epithelial cells and lung inflammation in mice[J].Free Radic Biol Med,2011,50(11):1492-1502.

[13]Li FF,Shen J,Shen HJ,etal.Shp2 plays an important role in acute cigarette smoke-mediated lung inflammation[J].J Immunol,2012,189(6):3159-3167.

[14]Modelska K,Pittet JF,Folkesson HG,etal.Acid-induced lung injury.Protective effect of anti- interleukin- 8 pretreatment on alveolar epithelial barrier function in rabbits[J].Am J Respir Crit Care Med,1999,160(51):1450-1456.

[15]Cheung MC,Brown BG,Marino Larsen EK,etal.Phospholipid transfer protein activity is associated with inflammatory markers in patients with cardiovascular disease[J].Biochim Biophys Acta,2006,1762(1):131-137.

[16]Cavusoglu E,Marmur JD,Chhabra S,etal.Elevated baseline plasma phospholipid protein(PLTP)levels are an independent predictor of long-term all-cause mortality in patients with diabetes mellitus and known or suspected coronary artery disease[J].Atherosclerosis,2015,239(2):503-508.

[17]Gautier T,Klein A,Deckert V,etal.Effects of plasma phospholipidtransfer protein deficiency on lethal endotoxemia in mice[J].J Biol Chem,2008,283(27):18702-18710.

[18]Barlage S,Froehlich D,Bottcher A,etal.ApoE-containing high density lipoproteins and phospholipid transfer protein activity increase in patients with systemic inflammatory response[J].J Lipid Res,2001,42(2):281-290.

[19]Levels JL,Pajkrt D,Schultz M,etal.Alterations inlipoprotein homeostasis during human experimental endotoxemia and clinical sepsis[J].Biochim Biophys Acta,2007,1771(12):1429-1438.

[20]Schlitt A,Liu J,Yan D,etal.Anti-inflammatory effects of phospholipid transfer protein(PLTP)deficiency in mice[J].Biochim Biophys Acta,2005,1733(2-3):187-191.

[收稿2015-07-15修回2015-07-23]

(编辑倪鹏)

Effect of PLTP on CSE-induced IL-8 production in A549 cells

YUXiu-Ying,CHENYa-Juan,WUFeng-Ping,ZOULin-Lin,CHENYu-Han,LIYou-Lun.

DepartmentofRespiratoryMedicine,FirstAffiliatedHospital,Chongqing400016,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of PLTP gene on CSE-induced IL-8 production in human alveolar Type Ⅱ cells(Adenocarcinomic human alveolar epithelial cells，A549).Methods: The different concentrations of CSE co-cultured with human alveolar epithelial cell line(A549) for 24 hours.MTT assay was performed to study the effect of CSE on human alveolar epithelial cell line(A549) growth.Expression levels of PLTP mRNA and IL-8 mRNA were examined by RT-PCR,protein of PLTP were examined by Western blot,and protein of IL-8 was examined by ELISA.Results: MTT assay showed that the proliferation of A549 cell line were stimulated by the 0.125% CSE,while the proliferation of A549 cell tends to decrease at high concentrations of CSE(2.0% CSE and 4.0% CSE),and in this middle concentrations of CSE(0.25% CSE ,0.5% CSE and 1.0% CSE),the proliferation of A549 cell was not significantly affected.Our studys suggested that PLTP and IL-8 release were induced by CSE in a concentration-dependent and time-dependent manner,and expression levels of IL-8 obviously increased after silence PLTP gene.Conclusion: PLTP siRNA can increased CSE-induced IL-8 production in human alveolar epithelial cells(A549).

[Key words]Cigarette Smoke Extract;Human alveolar Type Ⅱ cells;A549;PLTP;IL-8

中图分类号R563.19

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0318-05

作者简介：余秀英(1989年-)，女，在读硕士,主要从事呼吸系统疾病研究，E-mail：405426832@qq.com。通讯作者及指导教师：黎友伦(1965年-)，男，博士，教授，主要从事肺结核、肺癌等方面的研究，E-mail:liyoulun83@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.005

①本文为国家自然科学基金青年基金(81200009)、重庆市卫生局中医药研究课题(ZY20132165)和国家临床重点专科专项资助(卫办医政函[2012]649号)。