六味地黄丸对自发性2型糖尿病模型小鼠胰岛素表达水平的影响①

吕　璐　郑源强　张精彩　李斯琦　王晓东　尹　星　徐　佳　韩新荣　石艳春

(内蒙古医科大学自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特010058)



六味地黄丸对自发性2型糖尿病模型小鼠胰岛素表达水平的影响①

吕璐郑源强张精彩②李斯琦②王晓东②尹星②徐佳②韩新荣②石艳春

(内蒙古医科大学自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特010058)

[摘要]目的：探讨不同剂量六味地黄丸对自发性2型糖尿病模型小鼠血清和胰岛内胰岛素表达水平的影响。方法：将6～8周龄自发性2型糖尿病模型小鼠(KK-Ay小鼠)随机分3组(无药对照组、低剂量组、高剂量组)，C57BL/6J小鼠作为遗传对照组，各组小鼠分别给予蒸馏水或六味地黄丸灌胃15周。每周测定空腹血糖、体质量、摄食量；给药15周后，ELISA法测定小鼠外周血血清胰岛素含量，免疫荧光法和免疫组织化学法检测胰岛中胰岛素表达水平，比较各组检测结果。结果：六味地黄丸给药后，KK-Ay小鼠空腹血糖降低，体质量和摄食量得到控制；给药组小鼠血清胰岛素含量和胰岛内胰岛素表达水平明显降低，且低剂量组的降低程度比高剂量组更明显。结论：六味地黄丸对自发性2型糖尿病模型小鼠高血糖、肥胖、胰岛素抵抗具有一定的治疗作用，且低剂量组降低血清和胰岛内胰岛素水平的效果优于高剂量组。

[关键词]六味地黄丸；自发性2型糖尿病；动物模型；胰岛素抵抗；胰岛素

六味地黄丸初记于《小儿药证直诀》，由熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓六味药组成，主治肾阴虚。近年研究表明，六味地黄丸具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血压、降血糖、抗脂质过氧化损伤等功效[1，2]。糖尿病已经成为威胁人类健康的非传染性疾病之一，国际糖尿病联盟统计数据显示：2011年全球糖尿病人数已达到3.7亿，其中大多分布于发展中国家[3]，预计2035年全球将有近5.31亿糖尿病患者[4]。目前认为2型糖尿病是一种天然免疫和慢性亚临床炎症疾病，该病及其并发症的发生与机体低度炎症密切相关。炎症会影响胰岛B细胞功能，当炎症发生时全身组织会产生胰岛素抵抗现象[5-8]。临床实践中，六味地黄丸常用于糖尿病及其并发症的辅助治疗。本研究旨在探讨不同剂量六味地黄丸对自发性2型糖尿病模型小鼠的治疗作用尤其是对血清胰岛素含量和胰岛组织中胰岛素表达水平的影响，为更好地了解六味地黄丸对糖尿病及其并发症的治疗效果和作用机制提供一定的实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组自发性2型糖尿病模型小鼠(SPF级KK-Ay小鼠，雌性)24只，6～8周龄，随机分为3组，每组8只，即无药对照组、低剂量组和高剂量组。C57BL/6J小鼠8只，6～8周龄。KK-Ay小鼠和C57BL/6J小鼠的体质量均为18～20 g/只。购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004。C57BL/6J小鼠作为遗传对照组，即正常组。高糖饲料：购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2009-0008。

1.1.2主要试剂及仪器浓缩六味地黄丸[北京同仁堂(集团)有限责任公司]，小鼠血清胰岛素ELISA试剂盒(RD Systems)，anti-insulin单克隆抗体(BD公司)，FITC标记羊抗兔IgG二抗(Sigma公司)，封闭液(北京康为世纪生物科技有限公司)，DAB试剂盒(武汉博士得生物工程有限公司)。主要仪器：ZEISS Axio observer Z1活细胞工作站，Olympus图像采集分析系统等。

1.2方法

1.2.1小鼠灌胃给药并监测平均空腹血糖、体质量及平均摄食量变化各组小鼠购买后先进行2周适应性饲养，并全程给予高糖饲料。第3周开始灌胃给药，各组每只小鼠灌胃0.1 ml/次，2次/日。六味地黄丸用无菌蒸馏水配成混悬液，低剂量组和高剂量组的给药浓度分别为70和140 mg/ml(按照浓缩六味地黄丸药品说明书并根据开始灌胃时全部小鼠平均体重为37.51 g，综合换算给药量。140 mg/ml是按正常成人给药剂量换算而得，70 mg/ml为减半给药剂量)；无药组和遗传对照组给予同剂量无菌蒸馏水。每周一晚23∶00撤除饲料，次日早上7∶00测空腹血糖、体质量，计算平均摄食量。

1.2.2小鼠血清胰岛素含量检测灌胃给药15周后，每组随机抽取2只小鼠摘眼球取非抗凝外周血，37℃静置30 min析出血清后，1 500 r/min离心5 min，收集血清后-20℃保存。ELISA法检测小鼠血清胰岛素含量，操作步骤根据试剂盒说明书进行，每个样本设2个复孔。

1.2.3免疫荧光法和免疫组织化学法观察小鼠胰腺组织学变化(1)免疫荧光法:胰腺组织蜡块切片成4 μm厚度的石蜡带，用防脱载玻片捞片，烤片、脱蜡、水化后，经抗原修复、阻断内源性过氧化物酶活性、封闭液封闭后，滴加一抗(即胰岛素抗体)，4℃过夜，二抗(即FITC标记羊抗兔IgG二抗)室温孵育1 h，用DAPI对细胞核染色3 min，水溶性封片剂封片，荧光显微镜下观察。(2)免疫组织化学法:按照常规方法及DAB试剂盒说明书操作。

2结果

2.1各组小鼠平均空腹血糖、体质量及平均摄食量变化

2.1.1平均血糖值变化高剂量组小鼠的平均血糖在第1～3周直线升高，在第3周后下降，之后在遗传对照组(血糖正常组)平均血糖波动区间波动。低剂量组小鼠的血糖在第1～3周也升高，增长斜率低于高剂量组，给药后2周仍有小幅度升高，随后下降，于给药4周后降到遗传对照组(血糖正常组)平均血糖波动区间并相对平稳波动。无药对照组小鼠的血糖在第1～3周升高(与高剂量组小鼠平均血糖值相近)后仍维持高水平状态，之后以高于低剂量组和高剂量组小鼠的平均血糖值的状态波动。统计学分析组间比较采用单因素方差分析：F=2.81，P=0.046<0.05，差异有统计学意义；采用LSD检验结果表明：高剂量、低剂量组、遗传对照组小鼠的平均血糖水平与无药对照组均有差异(P值分别为0.011、0.030、0.034，均<0.05)，高剂量组与低剂量组小鼠平均血糖值之间的差异不具有统计学意义(P=0.699>0.05)。结果如图1所示，说明六味地黄丸可以降低糖尿病模型小鼠的血糖水平。

2.1.2平均体质量变化遗传对照组小鼠平均体质量变化呈平直线，其余各组小鼠均在第1～3周升高，之后维持在高水平状态，且高剂量组和无药对照组小鼠的平均体质量变化相近，以高于低剂量组小鼠平均体质量的水平变化。统计学分析组间比较采用单因素方差分析：F=283.78，P=0.000<0.01，差异有统计学意义且差异显著；采用LSD检验结果表明：低剂量组小鼠的平均体质量变化与高剂量组和无药对照组均具有显著差异(P值均为0.000，均<0.01)。结果如图2所示，提示低剂量给药方案对小鼠体质量的控制效果优于高剂量组。

2.1.3平均摄食量变化无药对照组和遗传对照组小鼠的平均摄食量波动范围较大；高剂量组小鼠在给药5周前波动较大，之后在略高于低剂量组的水平以小幅度波动；低剂量组在给药后波动范围小。

低剂量组小鼠的平均摄食量低于无药对照组和高剂量组，且差异有统计学意义(采用两个独立样本的秩和检验，Z值分别为-2.073和-2.972，P分别为0.038和0.003)；高剂量组和无药对照的平均摄食量差异不具有统计学意义(采用两个独立样本的秩和检验，Z=-1.060，P=0.289)。结果如图3所示，说明低剂量给药方案对小鼠摄食量的控制效果优于高剂量组。

图1　各组小鼠饲养18周平均血糖含量比较Fig.1　Concentrations of fast blood glucose in different groups of mice in 18 weeks

2.2血清胰岛素含量的变化各组小鼠胰岛素ELISA检测结果显示：无药对照组明显高于其余各组，呈高胰岛素血症样；低剂量组和高剂量组均高于遗传对照组，且低剂量组胰岛素水平低于高剂量组，结果如图4所示，表明六味地黄丸可以降低自发性2型糖尿病小鼠的血清胰岛素水平。

图2　各组小鼠饲养18周平均体质量变化Fig.2　Average body weight in different groups of mice in 18 weeks

图3　各组小鼠饲养18周平均摄食量比较Fig.3　Average food consumptions in different groups of mice in 18 weeks

图4　各组小鼠血清胰岛素含量Fig.4　Insulin concentrations in sera from different groups of miceNote: **.P<0.01; *.P<0.05.1.No drug control;2.Hight-dose；3.Low-dose；4.Genetic control.

图5　免疫荧光法检测小鼠胰腺组织胰岛素表达水平(×100)Fig.5　Immunofluorescence results of pancreases from different groups' mice(×100)Note: A. No drug control group; B. High-dose group; C. Low-dose group; D. Genetic control group; E.PBS control.

图6　免疫组织化学法检测小鼠胰腺组织胰岛素表达水平(×100)Fig.6　Immunohistochemistry results of pancreases from different groups′ mice(×100)Note: A. No drug control group; B.High-dose group; C.Low-dose group; D.Genetic control group; E.PBS control.

2.3胰岛组织中胰岛素表达水平检测结果由免疫荧光法和免疫组织化学法检测结果可以看出，无药对照组小鼠胰岛中胰岛素水平很高，明显高于其余各组；低剂量组小鼠胰岛中胰岛素表达水平低于高剂量组，见图5、6。

3讨论

糖尿病(DM)尤其是2型糖尿病已成为威胁我国人民生命健康的最重要非传染性疾病之一，但确切的发病机制尚待进一步深入研究，糖尿病的迁延不愈及长期用药导致的机体病变成为目前比较棘手的问题。六味地黄丸是中医治疗该病的代表方剂之一，临床上广泛用于糖尿病及其并发症的辅助治疗。KK-Ay小鼠作为典型的自发性2型糖尿病模型小鼠，于1957年由日本学者通过植入黄色肥胖基因(Ay基因)到KK/Ta鼠后培育而成，该小鼠通常被认为是一种多基因疾病模型，其自发表现出高血糖、糖耐量异常、高胰岛素血症、轻度肥胖症，与人的发病特征相似[9]。本研究所用雌性KK-Ay鼠均于10～12周龄左右出现体质量增加、血糖升高，出现典型的2型糖尿病症状，而遗传对照组C57BL/6J小鼠未出现。实验结果表明：无药对照组小鼠的血糖明显高于其余各组，说明六味地黄丸具有降血糖的功效，高、低剂量组对血糖的影响差异不具有统计学意义。治疗组小鼠血清胰岛素和胰岛内胰岛素含量显著降低，且六味地黄丸延缓了小鼠血糖升高程度及高血糖的出现。上述结果提示，六味地黄丸有助于控制血糖、降低胰岛素表达，可能具有促进胰岛素与脏器作用，增加脏器对胰岛素的敏感性，从而减轻KK-Ay小鼠高胰岛素血症样症状。杜华等研究结果也提示六味地黄丸能够改善OLEFT大鼠肝脏胰岛素抵抗[10]。此外，通过每周对小鼠体质量和摄食量的观察结果发现，治疗组小鼠的体质量、摄食量均得到较好的控制，且低剂量组效果好于高剂量组。

本实验探讨了六味地黄丸对KK-Ay小鼠的治疗作用尤其是对血清胰岛素含量和胰岛组织中胰岛素表达水平的影响，并对药物剂量进行了比较研究，实验结果证实了六味地黄丸对KK-Ay小鼠具有明显的治疗作用，同时发现低剂量组的综合治疗效果达到甚至优于高剂量组。中医讲究辩证施治，针对糖尿病病程、主要临床症状、累及主要脏器及其损伤程度等进行差异化治疗。本研究进一步提示六味地黄丸对2型糖尿病的治疗作用可能与其具有降低血糖、降低胰岛素表达等相关，同时给药剂量与治疗效果之间存在相关性，该实验结果对指导临床用药具有一定的参考价值。

参考文献：

[1]丘志峰.使用六味地黄丸治疗2型糖尿病肾病的疗效分析[J].当代医药论丛,2015,13(7):45-46.

[2]谢奇.六味地黄丸在2型糖尿病治疗中的作用与研究[J].中医临床研究,2013,5(1):116-118.

[3]中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2013年版)[J].中国糖尿病杂志,2014,6(7):447-498.

[4]Ramachandran A,Snehalatha C,Ma RC.Diabetes in South-East Asia:An update[J].Diabetes Res Clin Pract,2014,103(2):231-237.

[5]Johnson AM,Olefsky JM.The origins and drivers of insulin resistance[J].Cell,2013,152(4):673-684.

[6]Talukdar S,Oh da Y,Bandyopadhyay G,etal.Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase[J].Nat Med,2012,18(9):1407-1412.

[7]Winer S,Winer DA.The adaptive immune system as a fundamental regulator of adipose tissue inflammation and insulin resistance[J].Immunol Cell Biol,2012,90(8):755-762.

[8]Huang Q,Xue J,Zou R,etal.NR4A1 is associated with chronic low-grade inflammation in patients with type 2 diabetes[J].Exp Ther Med,2014,8(5):1648-1654.

[9]Tomino Y.Lessons from the KK-Ay mouse,a spontaneous animal model for the treatment of human type 2 diabetic nephropathy[J].Nephrourol Mon,2012,4(3):524-529.

[10]杜华,薛耀明,朱波.六味地黄丸改善OLETF鼠肝脏胰岛素抵抗的实验研究[J].南方医科大学学报,2012,32(12):1824-1827.

[收稿2015-11-06修回2016-02-03]

(编辑许四平)

Effects of Liuweidihuang pill on insulin levels in sera and pancreatic islets from spontaneous mouse models of human type 2 diabetes administrated with different doses

LÜLu,ZHENGYuan-Qiang,ZHANGJing-Cai,LISi-Qi,WANGXiao-Dong,YINXing,XUJia,HANXin-Rong,SHIYan-Chun.

InnerMongoliaKeyLaboratoryofMolecularBiology,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010058,China

[Abstract]Objective:To investigate the effects of Liuweidihuang pill on the insulin levels in sera and pancreatic islets from spontaneous mouse models of human type 2 diabetes administrated with different doses.Methods: The 6-8 week-old KK-Ay mice were randomly divided into three groups including no drug control group,low-dose group and high-dose group,in addition C57BL/6J mice were used as a genetic control group.All the animals were given with different dose Liuweidihuang pill solutions or sterile distilled water by intragastrical administration for fifteen weeks.The fasting blood glucose,body mass and food consumption were measured weekly.The serum insulin levels were surveyed by ELISA.And the insulin levels in the pancreas islets were detected by immunofluorescence and immunohistochemistry.Results: Decreased fasting blood glucose,controlled body mass and food consumption,and lower levels of insulin in the sera and pancreas islets were confirmed from the KK-Ay mice administered with Liuweidihuang pill.Furthermore,the low dose program exhibits a stronger effect.Conclusion: Liuweidihuang pill has exhibited relatively therapeutic effects in the spontaneous type 2 diabetes mice including controls of hyperglycemia and body mass and relieving insulin resistance.In addition,the low-dose regimen showed even better treatment in controlling insulin levels in the sera and pancreas islets.

[Key words]Liuweidihuang pill;Spontaneous type 2 diabetes;Animal model;Insulin resistance;Insulin

中图分类号R967

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)03-0350-04

作者简介：吕璐(1988年-)，女，主要从事抗感染免疫与中药免疫研究，E-mail: 805614039@qq.com。通讯作者及指导教师：石艳春(1958年-)，女，教授，主要从事抗感染免疫与疫苗研究，E-mail: ycshi5388@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.012

·中医中药与免疫·

①本文为内蒙古自治区自然科学基金(2012MS1126)，内蒙古医科大学英才培育项目资助。

②内蒙古医科大学护理学院，呼和浩特010058。

韩新荣(1957年-)，男，教授，主要从事中医药与免疫学研究工作。