搜风祛痰中药对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块自噬相关蛋白beclin1和LC3的影响

倪小鸥，宫丽鸿，张　湜，白光彪

1．辽宁中医药大学(辽宁沈阳 110032)，E-mail：18640253400@163．com；2．辽宁中医药大学附属医院



搜风祛痰中药对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块自噬相关蛋白beclin1和LC3的影响

倪小鸥1，宫丽鸿2，张湜1，白光彪1

1．辽宁中医药大学(辽宁沈阳 110032)，E-mail：18640253400@163．com；2．辽宁中医药大学附属医院

摘要：目的观察搜风祛痰法中药复方稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化(AS)不稳定斑块自噬相关蛋白beclin1和LC3的影响。方法建立ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块模型，并设立空白组、模型组、西药组及稳斑汤低、中、高剂量组。实验周期1个月，麻醉处死小鼠取主动脉组织HE染色后在光学显微镜下进行病理学观察，然后采用Western blot法检测beclin1及LC3的蛋白表达水平。结果beclin-1蛋白表达结果显示：与空白对照组比较，模型对照组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平显著降低(P<0．01)；与模型对照组比较，中药中剂量组、中药高剂量组、西药组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0．01)；中药高剂量组与西药组无统计学意义(P>0．05)。LC3蛋白表达结果显示：与空白对照组比较，模型对照组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平显著降低(P<0．01)；与模型对照组比较，中药各剂量组及西药组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平显著升高(P<0．01)；中药高剂量组与西药组无统计学意义。结论搜风祛痰法中药复方稳斑汤对于beclin1与LC3的蛋白表达密切相关，即搜风祛痰法中药复方稳斑汤可能通过影响beclin1与LC3的蛋白表达，从而影响动脉粥样硬化斑块的稳定性。

关键词：动脉粥样硬化；搜风祛痰中药复方；稳斑汤；ApoE基因敲除小鼠；不稳定斑块；自噬相关蛋白；beclin1；LC3

动脉粥样硬化(AS) 是由于动脉血管内膜出现了黄色的胆固醇、类脂肪，逐渐血栓形成，纤维组织增生及钙质沉着，日久出现动脉管壁钙化。AS疾病普遍存在内皮功能障碍，成为导致或加重AS的重要因素之一[1]。在由AS所导致的疾病或与之相关的疾病中，对疾病的预后和死亡率有着非常重要的关系。AS斑块普遍认为分成：内皮细胞损伤、脂质条纹形成及纤维斑块和复合斑块三步。AS斑块的发生发展受遗传和环境多种因素影响[2]。细胞利用溶酶体途径实现过多或衰亡的细胞器及损伤蛋白的降解即为自噬[3]。作为自噬相关蛋白的Beclin1 和LC3 均是参与自噬体形成的重要基因，Beclin1 是自噬特异性基因，而微管相关蛋白1 轻链31( LC3) 是自噬标志性基因，是自噬特异的诊断指标之一[4]。本实验以ApoE基因敲除小鼠为研究对象，给予中药复方稳斑汤，观察自噬基因becl- in1和LC3的蛋白表达情况，推断二者对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。

1材料与方法

1．1实验动物(6～8)周龄ApoE基因缺陷鼠(系C57BU6 J，北京大学实验动物中心美国Jackson实验室引进并培育成功)70只，SPF级，体质量18 g～20 g。

1．2药物稳斑汤药物组成：全蝎10 g，蜈蚣2条，地龙15 g，陈皮15 g，法半夏15 g，白术15 g，水蛭15 g。由辽宁中医药大学附属医院中药局提供，加工制成含生药2 g/mL的中药浓缩液备用。

1．3试剂和仪器Beclin-1，LC3一抗及相对应二抗购自北京博奥森生物科技有限公司；总蛋白提取试剂盒北京天恩泽生物科技有限公司；蛋白marber(北京索莱宝生物科技有限公司)；ECL发光试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。

1．4模型制备高脂饲料(含0．15%胆固醇)喂养13周后，随机处死4只。取主动脉根部，HE染色观察AS硬化程度，确定造模成功。

1．5分组及给药取60只ApoE基因敲除小鼠，随机抽取12只，建立模型组。随机抽取4组治疗组，每组12支建立稳斑汤低剂量组、稳斑汤中剂量组、稳斑汤高剂量组及西药组。按成人服用量，换算小鼠(小鼠的体质量折算系数9．0折算)用量。稳斑汤低剂量组61．75 g/(kg·d)，稳斑汤中剂量组123．5 g/(kg·d)，稳斑汤高剂量组247 g/(kg·d)，西药组予阿托伐他汀0．27 g/(kg·d)，模型组给予生理盐水0．3 mL/d。按体质量系数比折算成小鼠用量灌胃给药，每日1次。各组干预时间为1周。另随机取正常C57BL/6J小鼠12只正常饲料喂养13周，设为空白组。处死全部小鼠，无菌条件下取出主动脉冻存于-80℃冰箱中备用。

1．6观察指标①主动脉组织病理学观察。每组随机取10只小鼠，麻醉处死，无菌条件下在每只小鼠的主动脉根部取4个相同的切面。切面分别为：升主动脉近端横截面，切面形态呈圆形；主动脉瓣附着部位，并有冠状动脉开口：主动脉瓣起始横截面；主动脉瓣完全出现并汇合在一起。取材后用生理盐水冲洗，10%甲醛中性溶液固定。常规石蜡包埋，均匀间断切片，厚5 μm。①HE染色：普通光镜下观察主动脉根部组织及斑块的形态结构。②将组织从冰箱中取出，融化，按照组织净重与裂解液1∶10加入蛋白提取试剂，并用玻璃匀浆器在冰上进行匀浆，匀浆后静置于冰上20 min，10 000 r/min进行离心，离心15 min，分离上清液即为总蛋白备用。采用考马斯亮蓝法对各组总蛋白进行蛋白定量，每孔上样20 μg总蛋白进行电泳，半干转印法将蛋白转至PVDF膜，一抗(1∶200)4℃孵育过夜、二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，ECL发光，胶片曝光，扫描胶片，分别测定目的蛋白和内参β-actin条带灰度值，并用目的蛋白灰度值/内参灰度值的比值表示该目的蛋白表达水平，进行统计分析。

2结果

2．1腹主动脉组织HE染色结果根据以往实验得出ApoE基因敲除小鼠腹主动脉组织HE染色在光镜下观察结果，空白对照组动脉内膜附有一层内皮细胞，内皮细胞层呈现皱褶状排列，但排列均匀，表面光滑，未见泡沫细胞及炎性细胞；模型对照组：血管腔内可见明显的粥样硬化斑块出现，斑块表面附有纤维帽，纤维帽主要由平滑肌细胞、弹力纤维和胶原组织构成，斑块中央可见大量的脂质聚集，斑块内可见大量泡沫细胞，偶见炎性细胞浸润，未出现斑块的动脉内膜区域严重破损；稳斑汤低剂量组：血管腔内可见粥样硬化斑块，斑块面积明显小于模型对照组，斑块内脂质含量较模型组少，斑块内可见少量泡沫细胞及炎性细胞，未出现斑块的动脉内膜区域形态较为完整，偶见内膜残缺；稳斑汤中剂量组、稳斑汤高剂量组、西药组：动脉内膜大部分较为光滑，偶见内膜不全，内膜不全区域可见明显的脂质条纹块形成，偶见泡沫细胞聚集，有少量纤维成分交联。

2．2各组小鼠腹主动脉组织中beclin1的表达水平(见表1、见图1)与空白对照组比较，模型对照组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平显著降低(P<0．01)；与模型对照组比较，中药中剂量、中药高剂量、西药组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0．01)；与西药组比较，中药高剂量组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平无显著变化(P>0．05)。

表1　各组小鼠腹主动脉组织中beclin1

注：1为空白对照组；2为模型对照组；3为低剂量组；

2．3各组小鼠腹主动脉组织中的LC3蛋白表达水平(见表2、图2)与空白对照组比较，模型对照组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平显著降低(P<0．01)；与模型对照组比较，中药各剂量组及西药组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平显著升高(P<0．01)；与西药组比较，中药高剂量组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平无统计学意义。

表2　各组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平(±s)

注：1为空白对照组；2为模型对照组；3为低剂量组；

3讨论

冠状动脉粥样硬化是冠心病的病理基础。Ross等[5]指出AS是一种炎性疾病，自噬相关蛋白在AS的发生发展过程中具有重要作用。自噬蛋白可影响感染性疾病及炎症性疾病的病理过程，而且在非细菌感染相关的组织损伤所诱发的炎症反应中也能发挥抗炎效应[6]。自噬还能够抑制动脉粥样硬化的发生和发展。已有的研究结果较一致认为自噬对粥样硬化具有保护作用[7]。通过自噬清除细胞内的损伤成分，保护细胞抵御各种应激，防止细胞发生凋亡和坏死。

Beclin-1 基因是第一个被研究的自噬基因，对自噬体的形成至关重要[8-9]；微管相关蛋白LC3 是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因8(ATG8)的同源物，LC3 的表达含量与自噬泡含量数的多少呈正相关，因此，LC3被认为是自噬体的标志分子，可作为检测机体自噬程度的基因检测物，近来研究发现，ox-LDL 能够诱导血管内皮细胞自噬，导致微管相关蛋白LC3 和Beclin-1 表达增加，在过量胆固醇存在的情况下，LC3Ⅱ蛋白含量明显升高，大量自噬泡聚集，自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)明显抑制由胆固醇负荷所诱导的自噬，促进动脉粥样硬化的发生[10-11]。本研究结果表明，与空白对照组比较，模型对照组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白、LC3蛋白表达水平显著降低，该结果与以往研究结果一致，说明动脉粥样硬化发生时，可引起beclin1蛋白、LC3蛋白表达水平的降低。而中药各剂量组与西药组均能不同程度的提高beclin-1蛋白、LC3蛋白的表达，进而提高自噬相关蛋白的活性。这说明上调自噬相关基因beclin-1 蛋白和LC3 蛋白的表达，可以增强机体的抗氧化作用，进一步减少血管内脂质的浸润，阻止氧化应激反应的进展从而预防动脉粥样硬化的形成及发展。本实验观察到搜风祛痰中药复方稳斑汤干预后ApoE基因敲除小鼠体内自噬相关基因beclin-1蛋白和LC3蛋白的表达有所增加，血管内粥样斑块的脂质浸润明显减少，斑块更趋稳定。

从古到今，众医家认为胸痹是由于气亏，痰浊，瘀血，气滞，寒凝而引起心脉痹阻不畅而至。而这些是从病理机制而言，所以胸痹存在痰湿、阴虚及血瘀等临床分型。这些分型只不过是在胸痹发展过程中的不同病理阶段或是所表现的侧重点不同。本研究主要从痰、瘀、热三方面兼夹转化的病理基础为点，探讨治疗方法。中医学认为心气不足，推动无力，心阴失养，阳微而阴弦，痰瘀阻络脉道不利，而更主要的是三者杂合，交结为患，日久不化，酿成浊脂，浸于脉管。所谓“阳微”，是指胸阳不足，所谓“阴弦”，是痰饮阻滞。《医学心悟》曰“其人脏腑素有郁热，则风乘火势，火借风威，热风悱郁不得宣泄，而为热风矣”。本实验选用本院经验方复方稳斑汤，方用全蝎、蜈蚣、地龙共为君药，以达熄风止痉、解毒散结，通络止痛平喘之功。 以陈皮、半夏、白术为臣，既能燥湿化痰又可宽胸理气、消痞散结；水蛭破血逐瘀，为佐药。共奏搜风祛瘀，通络散结之功效。

干预 beclin-1与LC3的蛋白表达将成为防治 AS的新靶点。本实验结果表明搜风祛痰中药复方稳斑汤与西药阿托伐他汀钙片治疗AS的效果具有相同作用，搜风祛痰中药复方稳斑汤可以提高beclin-1与LC3的蛋白表达，这可能是搜风祛痰中药复方稳斑汤增强粥样动脉硬化斑块稳定性的机制之一。

参考文献：

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[5]Ross R．Atherosclerosis： an inflammatory disease [J]．N Engl J Med，1999，340： 115-126．

[6]何贤辉，何健欧．细胞自噬与炎症反应相互作用的研究进展[J]暨南大学学报，2013，4：125-128．

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[10]Mizushima N．Methods for monitoring autophagy [J]．Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12)：2491-2502．

[11]Xu K，Yang Y，Yan M，et al．Autophagy plays a protectiverole in free cholesterol overload-induced death of smooth muscle cells[J]．Lipid Res，2010，51：2581-2590．

(本文编辑王雅洁)

Effects of Expelling Wind to Eliminate Phlegm Methed on the Expression of Beclin-1 and LC3 in ApoE Gene Knockout Rats with Atherosclerosis Unstable Plaque

Ni Xiaoou，Gong Lihong，Zhang Shi，Bai Guangbiao

Lingning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，Liaoning，China

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Wenban decoction(WBD) with the function of expelling wind to eliminate phiegm beclin-1 and LC3 in ApoE gene knockout rats with atherosclerosis(AS)on unstable plaque．Methods Six to eight weeks old ApoE gene-deficient rats were selected to establish AS unstable plaque modle，and then they were given low-dose，medium-dose，high-dose WBD and western medicine for a month．At the same time，the modle group was fed by normal saline for one month．Then aortic tissue was under optical microscope pathology after Hematoxylin and Eosin (HE) staining．And then levels of beclin-1 and LC3 were detected by western blot technique．ResultsBeclin-1 expression levels in aortic tissue of rats in middle-dose WBD group，high-dose WBD group and western medicine group was significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant(P<0．01)．LC3 expression levels in aortic tissue of rats in treatment groups was significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant(P<0．01)．ConclusionWBD with the function of expelling wind to eliminate phiegm can influence the expression stability of atherosclerotic plaque by regulating beclin1 and LC3 protein．

Key words：atherosclerosis；expelling wind to eliminate phiegm treatment；Wenban decoction；ApoE grne knockout rats；unstable plaque；autophagy；beclin-1；LC3

(收稿日期：2015-11-25)

中图分类号：R285

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．05．012

文章编号：1672-1349(2016)05-0488-04

基金项目：中国博士后基金面上项目(No．20110491540)；辽宁省百千万人才项目(No．2011921022)；辽宁省自然基金项目(No．2014020055)

·基础医学论著/研究·