基于特异性生物识别分子的黄曲霉毒素快速分析方法研究进展

曾昆 杜道林 薛永来

（江苏大学环境与安全工程学院 江苏大学环境生态研究所，镇江 212013）

基于特异性生物识别分子的黄曲霉毒素快速分析方法研究进展

曾昆 杜道林 薛永来

（江苏大学环境与安全工程学院 江苏大学环境生态研究所，镇江 212013）

黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌分泌的次级代谢产物，容易污染粮食作物及其制品，主要存在于发霉的粮食、豆类、坚果及与其相关食品中。黄曲霉毒素，具有极强的毒性和致癌性，尤其是黄曲霉毒素B1，是目前已发现的最强的天然致癌物质，严重威胁人类健康。目前食品中黄曲霉毒素的检测以高效液相色谱、液质联用等仪器分析方法为主，然而仪器分析方法具有设备昂贵、操作繁琐、需要专业人员等不足。近年来以特异性生物分子（抗体、重组抗体、适配体等）识别黄曲霉毒素，并结合不同的信号报告分子，建立了一系列黄曲霉毒素分析方法，检测快速、灵敏并易于操作，在食品安全领域广泛应用。着重从黄曲霉毒素的生物识别分子和信号报告分子两方面介绍目前黄曲霉毒素的快速检测手段，并对其进行比较和评价，同时对黄曲霉毒素快速检测方法的发展方向进行展望。

黄曲霉毒素；抗体；适配体；快速分析

黄曲霉毒素是一类由黄曲霉菌（Aspergiuus flavus）和寄生曲霉菌（Aspergiuus parasiticus）产生次生代谢产物的总称［1］，主要存在于发霉的粮食、豆类和坚果等中，已经发现的黄曲霉毒素有20多种。由于黄曲霉毒素在紫外灯照射下可以发出荧光，根据荧光颜色的不同，分为B（blue）和G（green）两大类［2］。常见的污染农产品的黄曲霉毒素主要有黄曲霉毒素B1（aflatoxinB1，AFB1）、黄曲霉毒素B2 （aflatoxinB2，AFB2）、黄曲霉毒素G1（aflatoxinG1，AFG1）、黄曲霉毒素G2（aflatoxinG2，AFG2），以及代谢产物黄曲霉毒素M1（aflatoxinM1，AFM1）、黄曲霉毒素M2（aflatoxinM2，AFM2），其中饲料中污染的黄曲霉毒素是AFB1、AFB2、AFG1、AFG2，而AFM1和AFM2是哺乳动物食用了黄曲霉毒素污染的饲料所产生的代谢产物，因此常见于牛奶中［3］。

黄曲霉毒素，尤其是AFB1，毒性极强，其毒性是氰化钾的10倍，是砒霜的68倍［4］。同时，黄曲霉毒素还是目前发现的最强致癌物质，其致癌力是奶油黄的900倍，是3，4-苯并芘诱发肝癌能力的4 000倍［5］，1993年，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一，即Ⅰ类致癌物质［6，7］。世界上已有100多个国家制定了食品中黄曲霉毒素的检测［8］。目前黄曲霉毒素的限量标准主要有3大类，分别针对AFB1、AFM1以及黄曲霉毒素总（AFB1+AFB2+AFG1+AFG2）。对于AFB1，欧盟的限量标准为2 μg/kg，我国国标（GB 2761-2011）规定AFB1的残留限量为0.5 μg/kg（婴幼儿食品）和5-20 μg/kg（粮食、豆类、坚果等）；对于AFM1，欧盟的限量标准为0.05 μg/kg，我国现行标准为0.5 μg/kg；欧盟规定黄曲霉毒素总量的标准为4 μg/kg，我国并没有对黄曲霉总量作出规定。

黄曲霉毒素的分析方法主要有化学分析方法、仪器分析方法、免疫分析方法等。其中化学方法，如薄层层析法，尽管操作简便，但由于其特异性差、灵敏度低等不足，近年来已较少应用；以高效液相色谱及其联用技术为主的仪器分析方法，灵敏度高、特异性强，被列为我国的国家标准（GB/T18979-2003），然而该方法需要对样本进行净化，并且操作繁琐，需要专业的人员，并不适用于现场快速检测。以抗原抗体特异性结合为基础的免疫分析方法，因其操作简便、灵敏度高、耗时短等优点，在食品安全快速检测领域应用广泛。近年来，随着生物技术的发展，具有与传统抗体类似功能的其他特异性生物识别分子，如重组抗体、适配体等已被报道，并且借助免疫分析方法的模式，建立了一系列的快速、灵敏的分析方法，用于黄曲霉毒素快速检测。为更加系统和全面地了解目前黄曲霉毒素快速分析方法的发展现状，本文对目前报道的黄曲霉毒素特异性识别分子以及各种分析方法在黄曲霉毒素检测方面的应用进行综述，并对该领域的发展方向提出展望。

1　黄曲霉毒素生物识别分子

生物识别分子是快速生物检测方法建立的核心，特异性的抗体是目前快速分析方法中最为常用的识别分子。常规的抗体制备方法需要大量的实验动物，并且免疫周期长，能够较好识别小分子的抗体并不容易获得。随着分子生物学技术以及材料科学的发展，与抗体具有类似功能的新型识别分子——重组抗体、核酸适配体、分子印迹等，被制备或合成，并引入到生物检测领域。

1.1抗体

以抗原-抗体特异结合为基础的免疫分析方法，在快速检测领域占据主导地位。抗体的特性直接影响分析方法的性状。当前报道的识别黄曲霉素抗体包括特异性抗体和广谱性抗体两大类，前者仅识别单一目标物，后者则可以结合结构类似的一类化合物。

1.1.1特异性抗体 张道宏等（Zhang）［9］获得一株特异识别AFB1的单克隆抗体3G1，亲和力为1.8×10-8L/mol，IC50达到1.6 ng/mL，与AFB2、AFG1、AFG2的交叉反应率分别为6.4％、＜0.02％和＜0.02％。管迪等［10］筛选到一株特异性识别AFM1的单克隆抗体2C9，亲和力为1.74×10-9L/mol，在牛奶中IC50达到67 ng/L，与AFB1、AFB2、AFG1、AFG2无交叉反应。Min等［11］制备了AFB1的单克隆抗体2C12，平衡解离常数（Equilibrium dissociation constants，Kd）为6.95×10-9mol，IC50达到8 ng/mL，与AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的交叉反应率分别为1.5％、4％、0.1％和0.4％，与AFM2、赭曲霉毒素（ochratoxins，OTA）、伏马毒素（fumon-isins，FMB1）、FMB2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、T-2毒素等的交叉反应率均低于0.01％。

1.1.2广谱性抗体 张道宏等［12］通过两步法筛选到5株广泛识别黄曲霉毒素的单克隆抗体，经进一步验证，其中1C11具有最高的灵敏度，对AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的IC50分别为1.2、1.3、2.2、18.0和13.2 pg/mL。李培武等（Li）［13］以AFG2作为竞争物，筛选到3株黄曲霉毒素广谱性抗体，针对标准品AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 和AFM1，8E11交叉反应率分别为100％、20.9％、88.4％、78.1％和87.6％；8F6交叉反应率分别为100％、103.8％、100.1％、47.0％和65.0％；10C9交叉反应率分别为100％、93.6％、95.4％、65.2％和70.9％。且IC50在1.25-5.99 ng/mL。

Liu等［14］采用EDC法合成抗原AFB1-CMOBSA，制备两株单克隆抗体3F6G11和9C7C11，对AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均有较好的识别能力，采用直接竞争法鉴定，3F6G11对AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分别为0.051、0.050、1.820 和1.270 ng/mL，9C7C11对AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分别为0.045、0.057、2.530和2.120 ng/mL。Liu等［15］采用EDC法合成抗原AFB1-CMOBSA，免疫兔子，获得AFB1多克隆抗体，经直接ELISA方法鉴定该抗体对AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分别为0.15、0.55、0.32和3.83 ng/mL。Wang等［16］合成AFM1-CMO-BSA完全抗原，免疫兔子获得AFM1多克隆抗体，该抗体对AFM1和AFB1的IC50分别为0.014和0.02 ng/mL。

1.2重组抗体

1994年出现的基因工程抗体，可以根据研究的需要在基因水平对免疫球蛋白进行切割、拼接或修饰，进而通过体外表达方式产生重组抗体［17］。相对于传统抗体，重组抗体具有库容量大（＞106）、避免使用实验动物、增加特异性和亲和力等优点，在快速诊断领域有较广泛的应用［18］。

Moghaddam等［19］在噬菌体抗体库中筛选到15株单链抗体（single-chain variable fragment，scFv），并对其中12株进行鉴定发现其中5株对AFB1有较好的识别能力，其中Afla-45对AFB1的亲和力可达6×10-9L/mol。交叉反应结合显示，Afla-45对50 nmol/L AFG1也有较好的识别能力，但不能有效结合同样浓度的AFM1、AFM2以及赭曲霉素。Min等［11］通过克隆其获得的单克隆抗体2C12的可变区基因，筛选到识别AFB1的scFv，经表面等离子体共振传感器（surface plasmon resonance，SPR）检测其Kd为1.16×10-7mol，比单克隆抗体2C12高出17倍，即scFv的亲和力显著低于单克隆抗体。作者认为导致scFv亲和力降低的原因在于scFv仅具有单一结合位点，而抗体分子具有两个结合位点［20］。

除单独表达重组抗体外，通过基因手段融合表达抗体-报告分子成为一种新兴的研究手段。Rangnoi等［21］从人噬菌体抗体库中筛选到特异性识别AFB1的scFv，并通过分子手段融合表达scFv-碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），经ELISA鉴定，YM1-C3的融合蛋白scFv-AP的灵敏度要高于scFv（IC50分别为0.04和0.12 μg/mL），与AFB2、AFG1、AFG2和AFM1的交叉反应率分别为26.92％、70％、29.17％和0.88％。刘蓉等［22］将抗AFB1-scFv与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）通过linker连接，转入不同的表达质粒，构建了8种重组质粒，其中两种pET32a-VH-GFP和pET32a-GFP-VH既有抗体活性，又有荧光活性，经检测，其抗体效价分别为0.92和0.506，纯化后蛋白激发波长为488 nm，在495 nm处可发射出的荧光强度分别为1 554和661.5。

1.3核酸适配体（Aptamers）

核酸适配体是一类能够以高特异性和灵敏度结合目标分子的寡核苷酸（RNA或单链DNA）或短核酸链，通过指数富集的配基系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）可以快速的从大容量的随机单链核酸序列库（1013-1015）中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体，靶物质包括蛋白质、小分子有机物、金属离子等［23］。对筛选到的适配体测序后，即可大量合成此识别分子。

Malhotra等［24］筛选到识别AFM1的aptamer 36株，Kd在35-1 515 nmol/L；识别AFB1 的aptamer 5株，Kd在96-221 nmol/L。通过Mfold software预测结构，将36株识别AFM1 的aptamer分为8组，其中有6组具有保守的二级结构，第7组aptamer能够形成G-四链体，还有9株aptamer并没有相似的结构，被归为第8组。有意思的是，亲和力最高的aptamer AFAS3（Kd = 35 nmol/L）属于第8组，具有两个重叠的茎环结构。Ma等［25］筛选到9株识别AFB1的aptamer，Kd在11.39-93.24 nmol/L，其中3株aptamer（编号1、13和27）与AFB2、AFG1、AFG2、OTA和FB1的交叉反应率＜15％。

2　信号报告分子

生物检测技术发展至今，已相继使用了多种标记物，如放射性同位素、酶、荧光素等，这些标记物的使用极大改善了分析方法的性状。由于部分标记方法复杂、标记物昂贵等不足，近年来研究者探索了多种无标记检测方法，其中以传感器应用最为广泛，通过物理、化学信号的改变实现分析物的定量/半定量检测。

2.1酶催化底物

管迪等［10］应用单克隆抗体2C9建立了AFM1 的ELISA方法，在牛奶中LOD为3 ng/L。Wang等［16］建立了直接竞争性ELISA方法，检测AFM1的IC50为0.014 ng/mL。Rangnoi等［21］用融合蛋白scFv-AP建立了一步法AFB1检测方法，检测限为2.3 ng/mL，线性范围2.3-5 000 ng/mL。

Fang等［26］以抗AFB1单克隆抗体包被微孔板，AFB1标准品或样品和HRP-AFB1-BSA竞争性与抗体结合，以鲁米诺-过氧化氢化学发光体系作为检测信号，AFB1检测限为0.01 ng/g，线性范围0.05-10 ng/g。

2.2荧光物质

2.2.1荧光素 Shim等［27］以Cy5标记DNA探针，和靶分子AFB1竞争性的与aptamer结合，建立了AFB1的试纸条分析方法，检测限可达0.1 ng/mL，并用于谷物样品检测，灵敏度为0.3 ng/g。Ma等［25］以将AFB1 aptamer 结合在Fe3O4纳米磁性颗粒上，用FAM标记aptamer互补序列，建立了AFB1的磁珠分析方法。当AFB1存在时，固化在磁珠上的aptamer优先与AFB1结合，FAM标记的互补序列存在于溶液中；当AFB1不存在时，固化在磁珠上的aptamer则与互补序列结合。因此通过磁性分离，上清中的荧光强度与AFB1的浓度成正比。该方法的LOD为35 ng/L，线性范围50-1 500 ng/L。Wang等［28］将6种毒素（AFB1、AFM1、呕吐毒素、赭曲霉毒素A、T-2毒素和玉米赤霉烯酮）的完全抗原固化在琼脂糖改性的载玻片，与游离抗原竞争性与相应的抗体结合，通过Cy3标记的二抗作为信号输出方式。对AFB1和AFM1的检测限分别为0.01 ng/mL 和0.24 ng/mL，线性范围在0.04-1.69 ng/mL和0.45-3.9 ng/mL。李军涛等［29］用FITC标记AFB1单克隆抗体，建立了的免疫荧光层析试纸条法检测食用油中的AFB1，检测限为5 ng/mL。

2.2.2量子点 Zhang等［30］用CdTe量子点标记AFB1单克隆抗体，建立的竞争性的免疫分析方法检测限可达0.016 ng/mL，用于花生样本检测的IC50为0.149 ng/mL。许琳等［31］将碳量子点（Carbon quantum dots，CQD）探针和石墨烯量子点（graphene quantum dots，GQD）荧光免疫探针与AFB1单克隆抗体共价偶联，表征后发现偶联后量子点均保持了较好的荧光特性，且与抗体偶联后的碳量子点的荧光特性优于石墨烯量子点，为量子点探针在AFB1检测中的应用奠定了基础。Xu等［32］以红色量子点（发射波长620 nm）标记AFB1单克隆抗体，绿色量子点（发射波长620 nm）标记半抗原，建立了一种均相荧光共振能量转移检测方法，对AFB1的检测限为0.04 ng/mL，线性范围0.06-5 ng/mL。

2.2.3其他荧光颗粒 Wu等［33］在磁珠表面偶联AFB1-BSA和OTA-BSA，并以在上转换纳米颗粒NaY0.78F4：Yb0.2，Tm0.02 和NaY0.28F4：Yb0.7，Er0.02分别修饰抗AFB1和抗OTA单克隆抗体，建立了多标记AFB1和OTA检测方法，其中AFB1检测限为0.01 ng/mL，线性范围0.01-10 ng/mL。Liu等［34］用荧光微球标记AFB1单克隆抗体，建立了可视化的免疫层析检测方法，检测限可达2.5 ng/mL。张兆威等［35］将黄曲霉毒素抗体与乳胶铕进行偶联标记，建立了时间分辨荧光免疫层析试纸条对AFB1进行检测，对花生、稻米、植物油等农产品的检测限均为0.3 ng/g，线性范围分别为0.8-25、0.8-15和0.8-30 ng/g。

2.3传感器

传感器技术涉及化学、生物学、物理学及电子学等多个领域，在临床医药、食品检验和环境保护等领域广为应用，其中电化学传感器是其中重要的一类。电化学传感器价格低廉，携带方便，便于操作，增强了传统的分析方法的性能。

2.3.1电流型电化学传感器 Paniel等［36］将AFM1抗体固化在超顺磁性纳米粒子上，进而通过磁性装置将包被后的磁性纳米颗粒组装在碳电极表面，AFM1以及AFM1-HRP的竞争性与AFM1抗体结合，构建的电化学传感器LOD为0.01 ng/mL，线性范围0.01-0.25 ng/mL。Parker等［37］采用标准的光刻方法将包含有35个微方电极的金微阵列以及对照电极和计数电极共同组装在芯片上，AFM1抗体固化在微电极上，建立了AFM1电化学芯片检测方法，在牛奶中检测限为8 ng/L，线性范围10-100 ng/L。Nguyen等［38］在叉指电极上修饰了聚合的四氧化三铁/聚苯胺薄膜，并通过戊二醛将AFM1 aptamer作为捕获原件固化在电极上，构建了AFM1电化学检测方法，检测限为1.98 ng/L，线性范围6-60 ng/L。

Lin等［39］用具有电活性的硫堇分子修饰中孔碳纳米颗粒，进而用戊二醛法将AFB1多克隆抗体偶联在中孔碳上，在玻璃电极表面修饰全氟磺酸膜。全氟磺酸膜带负电荷，偶联有抗体分子的纳米颗粒带正电荷，后者通过静电作用结合到电极上，随后纳米颗粒上携带的硫堇诱发阴极电流产生电化学信号，当有AFB1存在时，AFB1与其抗体特异性结合，诱导中孔碳纳米颗粒从电极表面解离，从而减弱了硫堇诱发的阴极电流，导致电化学信号变化。经过优化后该方法的检测限可达到3.0 pg/mL。Zhang等［40］在玻碳电极表面修饰单壁碳纳米管/甲壳素（singlewalled carbon nanotubes/ chitosan，SWNTs/CS），通过EDC法将AFB1-BSA固化在电极表面，AFB1和AFB1-BSA竞争性的与抗体结合，碱性磷酸酶标记的二抗与特异性抗体结合，碱性磷酸酶催化底物萘磷酸盐水解获得电化学信号。该方法检测限为3.5 pg/mL，线性范围0.01-100 ng/mL。Singh等［41］在氧化铟锡（indium tin oxide，ITO）玻璃电极表面修饰了羧基化的多壁碳纳米管（carboxylated multiwalled carbon nanotubes，c-MWCNTs），通过c-MWCNTs上的羧基将AFB1抗体组装在电极表面，构建了一种新型的电化学传感器用于AFB1检测。该方法最低检测限为0.08 ng/mL，线性范围0.25-1.375 ng/mL。

2.3.2阻抗型电化学传感器 孙兰秀等［42］采用溶胶凝胶法将AFB1抗体组装在玻碳电极表面，构建了电化学阻抗传感器，用于AFB1的检测，该方法对AFB1响应的线性范围为1.0-10 μg/L，检测限为0.1 μg/L。Li等［43］在玻碳电极上修饰了硅胶离子液体，为AFB1抗体固化提供了生物相容的微环境，建立了无标记的电化学阻抗免疫传感器方法，最低检测限为0.01 ng/mL，线性范围0.1-10 ng/mL。Yu等［44］在玻碳电极表面修饰碳纳米管/离子液体/抗体（MWCNTs/ionic liquid/Ab），采用电化学阻抗法检测AFB1，该方法检测限为0.03 ng/mL，线性范围0.1-10 ng/mL。Wang等［45］在电极表面修饰PPy/PPa/rGO （polypyrrole/Pyrrolepropylic acid/ grapheme oxide）膜，并将AFB1抗体组装在膜上，构建了一种新型的阻抗传感器，该方法检测限为10 fg/mL，线性范围10 fg/mL-10 pg/mL。Castillo等［46］在金电极表面修饰了Poly（amidoamine）dendrimers（PAMAM G4），通过戊二醛定向固化AFB1 aptamer，通过循环伏安法和电化学阻抗谱采集电化学信号，线性范围0.1-10 nmol/L。

Bacher等［47］在银线的表面组装特异性的AFM1单克隆抗体，通过阻抗的变化来监测AFM1与其特异抗体的结合，最低检测限为1 pg/mL，线性范围6.25-100 pg/mL。

2.3.3其他传感器 Rameil等［48］采用3-（4-hydroxyphenyl）propionic acid（p-HPPA）作为电子供体，构建了一种电位免疫传感器，其信号强度显著高于常规使用的电子供体（ABTS、OPD、TMB），并用于AFM1的检测，检测限为40 pg/mL，线性范围250-2 000 pg/mL。Lv等［49］在玻碳电极表面修饰了中孔碳/Ag纳米颗粒，并通过银离子上的氨基将鲁米诺和AFB1抗体组装在电极上，建立了一种电化学发光传感器，该方法检测限为50 fg/mL，线性范围0.1 pg/mL-50 ng/mL。Chauhan等［50］在金表面组装一层4-ATP，采用EDC法将AFB1抗体共价偶联在电极上，构建了一种无标记的电化学石英晶体微天平传感器，该方法检测限为0.1 ng/mL，线性范围0.1-4 ng/mL。Park等［51］通过分子生物学技术，将特异性与金结合的金结合蛋白（gold binding protein，GBP）和特异性与抗体结合的protein G融合表达，利用获得的融合蛋白GBP-ProG将AFB1抗体定向固化在传感器金膜的表面，采用SPR方法检测AFB1，检测限为1 μg/mL。Jin等［52］将BSA-AFB1固化在电极表面，游离的AFB1和BSA-AFB1与竞争性的与AFB1抗体结合，通过与偶联纳米金作为重量标签的二抗结合，诱发质量变化产生信号，构建了压电免疫传感器。该方法检测限为0.01 ng/mL，线性范围0.1-100 ng/mL。

2.4基于金颗粒的检测方法

以纳米金颗粒为信号、硝酸纤维素膜为固相载体的侧流层析方法或斑点免疫渗滤法，具有操作简便、快速、无需仪器设备、经济等优点，在快速分析领域占有重要位置。以抗体标记金颗粒，构建免疫层析分析方法，对AFB1或AFM1检测限可达1.0 ng/mL［9，14-16］；以斑点免疫渗滤法检测AFB1，可视化检测限可达2 ng/mL［53］。同时，在此基础上引入富集材料，可显著提高方法的检测限。黄艳梅等［54］采用包被有AFM1抗体的磁珠对样本中目标物进行富集，磁分离后的重悬液用于免疫层析试纸条检测，对于原料乳中AFM1的检测限可达0.1 ng/mL。

通过采用广谱性抗体或是多通道检测模式，实现了黄曲霉毒素多残留检测。张道宏等［55］应用广谱性抗体1C11建立了免疫层析分析方法，对AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的检测限可达0.03、0.06、0.12 和0.25 ng/mL。张道宏等［56］在常规的测流层析方法基础上，建立了一种基于颜色变化的半定量的可视化检测方法。在检测区，采用了多条检测线，并对其数目、间距、包被浓度以及喷射速率进行优化，最终优化后以3条检测线的模式实现AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的半定量检测，检测限分别为0.06、0.25、0.125和0.25 ng/mL。

基于金颗粒的物理性状变化的新型分析方法，近年来也有所发展。Xu等［57］将AFB1-BSA偶联在金纳米棒上（gold nanorods，GNRs），当溶液中没有靶分子AFB1时，游离的AFB1抗体与AFB1-BSA结合后，诱发GNRs聚集，而当溶液中存在AFB1时，AFB1抗体与溶液中的AFB1结合，无法结合到GNRs，因此GNRs保持分散状态。通过检测溶液的吸光度，构建了一种简单、快速的AFB1检测方法。该方法检测限为0.16 ng/mL，线性范围0.5-20 ng/mL。Malhotra等［24］以AFM1 aptamer 建立了基于金颗粒的可视分析方法，当AFM1含量超过250 nmol/L时可以观察到颜色的变化。

2.5其他

Hu等［58］合成了一种蒙脱石-聚丙烯酰胺纳米复合膜，吸附到复合膜上的AFB1的荧光强度与其在溶液中的浓度成正比，方法线性范围为50-1000 ng/mL，最低检测限9.72 ng/mL。Larou等［59］利用电穿孔仪将AFM1单克隆抗体插入Vero细胞的细胞膜中，当溶液中的靶物质与其抗体结合后，诱发细胞膜电位的变化，从而实现了AFM1的快速检测，该方法检测限可达5 pg/mL。

3　结语

黄曲霉毒素是一种高毒性的真菌毒素，可以污染许多重要的作物而进入到各种食物中，对人类健康产生重大威胁。以特异性的识别分子为基础的生物分析方法在黄曲霉毒素的检测中占据重要地位。特异性抗体是应用最为广泛的识别分子，近年来，随着分子生物学技术的发展，核酸适配体、重组抗体等新兴的识别分子被引入到快速分析领域，丰富了检测方法的种类，并为检测方法性状的改进提供了新的途径，但是由于稳定性不够、灵敏度不高等不足，以抗体为基础的分析方法仍然占据主导地位。在常规的ELISA方法基础上，新型标记物（荧光素、纳米颗粒等）的使用提高了检测方法的灵敏度；传感器技术，尤其是电化学传感器，与一些新型纳米材料，如多孔材料、碳纳米管、石墨烯等相结合，发展出了许多新型的电化学传感器，极大地提高了检测方法的灵敏度，从ng水平提高到fg水平。但是电化学传感器也有一定的局限性，如样品中存在电活性物质的干扰，长期的稳定性较差等。

各国对食品安全愈加重视，食品安全标准也会越来越严格，对检测方法的要求趋向高灵敏度、样品前处理简单、使用方便、稳定性好等。探索多种稳定性好、灵敏度高的识别分子、新型纳米材料的引入以及加强传感器技术的工业化、规模化等多种手段相结合，将会促进黄曲霉毒素检测向着便携化、操作简便、低成本、产业化方向发展。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Advances on Rapid Detection Methods for Aflatoxin Based on Biological Binders

ZENG Kun DU Dao-lin XUE Yong-lai
（1. College of Environmental and Safety Engineering，Institute of Environment and Ecology，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）

Aflatoxins are secondary metabolites secreted by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus，easily pollute the grains and their processed products，and mainly exist in moldy grain，legumes，nuts and associated food products. Aflatoxins are extremely toxic and carcinogenic，especially aflatoxin B1 that has been found to be the strongest natural carcinogen and severely threat to human health. Current detection methods of aflatoxins in the grains are mainly instrumental analysis by combining the high performance liquid chromatography and liquid mass spectrometry，however，instrumental analysis presents the shortcomings such as instruments cost is very high，analysis process is very complex and needs long-time-trained professionals. In recent years，integrating the rapid identification of aflatoxin based on biological binders（antibody，recombinant antibody，and aptamer）and different signal reporters，a series of analysis methods for aflatoxin were established，and they are fast，flexible，and easy to operate，therefore widely applied in food safety. Here we review the rapid detection methods mainly from 2 aspects of specific biological binders for aflatoxins and signal reporters，compare and evaluate them，also prospect the development trend of rapid methods for aflatoxin.

aflatoxin；antibody；aptamer；rapid detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.009

2015-11-18

国家自然科学基金项目（31502118，31170386，31570414），江苏省自然科学基金项目（BK20130507，BK2012274），中国博士后基金项目（2013M541606），江苏省农业科技自主创新资金［CX（13）3093］，江苏大学高级人才启动金（13JDG016），镇江市科技支撑计划项目（NY2013006），镇江市国际科技合作项目（GJ2014008）

曾昆，女，博士，研究方向：污染物快速分析；E-mail：kjj80116@163.com

杜道林，男，博士，研究方向：环境污染物生态效应；E-mail：daolindu@163.com