Cry毒素杀虫活性分子改造方法研究进展

郭雅洁,　李　苹,　伍忠玲,　郑茹萍,　张　俊,　胡　霞*

1.福建农林大学林学院, 福州 350002;

2.福建农林大学, 生物农药与化学生物学教育部重点实验室, 福州 350002



Cry毒素杀虫活性分子改造方法研究进展

郭雅洁1,2,李苹1,伍忠玲1,郑茹萍1,张俊1,2,胡霞1*

1.福建农林大学林学院, 福州 350002;

2.福建农林大学, 生物农药与化学生物学教育部重点实验室, 福州 350002

摘要：苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)产生的Cry毒素为防治害虫提供了一种宝贵的资源。但昆虫中肠蛋白酶的活化作用在不同的昆虫中对Cry毒素的杀虫活性有限制性。分析了几种不同的策略来增加Cry毒素对靶标昆虫的毒性，包括结构域Ⅲ交换、结构域Ⅱ和结构域Ⅲ的突变以及其他突变。此外，还详细阐述了噬菌体展示技术进行毒素优化的方法，毒素优化能够增加Cry毒素对亲本Cry毒素敏感度较低的害虫的杀虫活性，以期为Cry毒素的分子改造和应用提供参考。

关键词：苏云金芽胞杆菌；Cry毒素；进化；分子改造

苏云金芽胞杆菌(Bt)是一类分布极为广泛的革兰氏阳性菌，其杀虫活性主要来自芽孢形成期在菌体一端或两端形成的伴孢晶体，即杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，可分为Cry和Cyt两类。Bravo等[1]证实Bt能够有效防治主要的农作物害虫和携带登革热和疟疾病菌等人类疾病的蚊子。然而，苏云金芽孢杆菌作为生物杀虫剂使用是伴随着Bt转基因作物的发展开始的，其在农作物中表达的cry基因能够抵抗钻蛀性害虫在内的昆虫的攻击[2]。Bt内具有杀虫活性的晶体内含物是伴随着芽孢的形成而产生的，它们是由多种杀虫蛋白即Cry或Cyt毒素组成的。但这些毒素表现出较高的特异性，只能杀死小范围的昆虫物种。

已有数据表明Bt对鳞翅目、膜翅目和同翅目等16个目3 000多种害虫有杀虫活性[3]。然而，到目前为止仍然有许多害虫对于cry基因不敏感或不能被Cry蛋白有效控制。而在对转基因植物使用Cry毒素的过程中存在的主要问题是昆虫抗药性的出现，因此，在自然界中对于Cry毒素进行体外改造，以增强其对特定害虫的毒性，杀死新的靶标昆虫从而防止野外抗性的出现具有非常重要的意义。

1Cry毒素杀虫活性的体外进化

1.1Cry毒素的水解活性

在不同的昆虫物种中，昆虫中肠蛋白酶的活化作用是影响Cry毒素活性的关键步骤。Cry3Aa对于鞘翅目昆虫幼虫如马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)有很强的杀虫活性，而对玉米根萤叶甲(Diabroticavirgiferavirgifera)的毒性却很低，这是由于蛋白酶对Cry3Aa溶解度较低,而使其产生67 kDa的片段。然而，有研究证明通过糜蛋白酶处理能够增加完整的55 kDa Cry3A片段的产量，这表明在整个过程中Cry毒素的溶解性和毒性得到了增加[4]。经证明55 kDa的片段是结构域Ⅰ的α3-α4循环区域切割的片段[4]。在 Cry3Aa α3-α4的螺旋位置(命名为mCry3Aa)引进一个糜蛋白酶或组织蛋白G蛋白进行水解使55 kDa片段的产量增加，随之其对玉米根萤叶甲的毒性也得到了增加。mCry3Aa毒素的增加与55 kDa片段溶解度的增加有关，也与55 kDa片段和玉米根萤叶甲刷状缘膜囊泡(BBMV)的特异性结合有关[5]。同时，mCry3Aa对马铃薯甲虫的幼虫表现出了类似于Cry3Aa的杀虫活性，这表明位于mCry3Aa中的工程蛋白酶扩大了杀虫活性甚至改变了其昆虫特异性。在转基因玉米中mCry3Aa已经得到了较好的应用，能有效的防治玉米根萤叶甲[6]。

昆虫抗药性的出现制约了Cry毒素在转基因植物中的使用[7]。已有研究表明，不同的鳞翅类昆虫群落对Cry1Ab或Cry1Ac毒素的抗性与钙粘蛋白基因的突变有关[8]。与钙粘蛋白的结合对Cry1A毒素的活性是一个限制步骤，因为它是促进螺旋α1进一步水解移除并使毒素寡聚化所必需的。经证明，缺乏钙粘蛋白的蛋白酶激活的Cry1Ab和Cry1Ac毒素转基因植物删除螺旋α1 (Cry1AbMod 或 Cry1AcMod)在体外形成寡聚物，相比而言，自然毒素在钙粘蛋白结合位点存在时只形成低聚物的结构。对Cry1AbMod 和 Cry1AcMod有抗性的棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)Cry1Ac耐药品系与钙粘蛋白基因的突变有关[9]。这个结果表明Cry1AMod毒素有可能对抗昆虫抗药性，突变抗药性影响钙粘蛋白的表达。后续研究分析表明，Cry1AbMod和Cry1AcMod对7种不同的鳞翅类昆虫抗药品系的抵抗作用在某些情况下不会因突变影响钙粘蛋白的表达。Cry1Ac耐药品系的抗药性最近已被证明，Cry1Ac是ABC转运蛋白(ABCC2)基因突变的等位基因。ABCC2的突变影响着Cry1Ab 和Cry1Ac与刷状缘膜囊的结合能力，表明ABCC2 蛋白可以促进低聚物插入细胞膜[10]。同时，Cry1AMod毒素的分析包括两个领域，即小菜蛾(Plutellaxylostella)和粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的Cry1Ac耐药品系的进化，其与ABCC2转运体的基因突变有关[11]。数据显示，在这两种昆虫中，Cry1AMod有抗性，并且在烟草夜蛾幼虫包含ABCC2和钙粘蛋白突变等位基因的耐药品系中也有抗性。然而，Cry1AbMod和Cry1AcMod对烟草夜蛾幼虫中钙粘蛋白或ABCC2单突变体的昆虫群落并不是非常有效[12]。需重点说明的是，Cry1AbMod和Cry1Ac毒素对烟草夜蛾幼虫的易感抗性不是非常有效，并且也有明显的削减现象。这表明，低效的Cry1AbMod毒素对易感昆虫的抗性较低，如烟草夜蛾幼虫群落只有其钙粘蛋白基因或ABCC2基因受到Cry1AbMod毒素的影响，这可能是由于和亲本Cry1A 毒素相比，Cry1AbMod毒素活性降低所致。这些结果表明Cry1A毒素的作用方式要复杂的多，包括额外的蛋白质如ABCC2转运体，尽管Cry1AMod毒素在抵抗一些害虫时可能功效较低，他们可能基于不同的作用机制来产生抗药性[12]，其原因还有待分析，这可为Cry1AMod毒素的进一步改造提供思路。

1.2结构域Ⅲ交换

经分析表明，结构域Ⅲ被认为是一种参与Cry毒素进化的自然机制。在某些情况下，体外的不同Cry毒素的结构域Ⅲ交换产生毒性提高的混合毒素来对抗特定的昆虫[13]。de Maagd等[14]构建了一个混合毒素，包括来自 Cry1Ab毒素的结构域Ⅰ和结构域Ⅱ以及Cry1C的结构域Ⅲ，与Cry1C相比对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua) 显示出高6倍以上的毒性。岳琳等[15]将Cry1Ab的结构域Ⅰ和结构域Ⅱ以及Cry1Ac的结构域Ⅲ结合构建了新型的cryNAc抗虫基因，该转基因水稻也得到了较好的抗二化螟效果。根据结构域Ⅲ交换而改造的毒素对鞘翅目害虫如马铃薯甲虫的活性得到了提高，相比较而言，Cry1Ba 和 Cry1Ia对马铃薯甲虫显示出低毒性。 Naimov等[16]用Cry1Ia的结构域Ⅰ和结构域Ⅱ以及Cry1Ba的结构域Ⅲ构建了混合毒素，对马铃薯甲虫的杀虫活性比Cy1Ia和Cry1Ba亲本毒素分别高出3~7倍。根据结构域Ⅲ交换的原理改造毒素的另一个例子，即利用Cry3Aa的结构域Ⅰ和Ⅱ以及Cry1Ab(eCry3.1Ab)的结构域Ⅲ构建混合毒素。相较于Cry3Aa和Cry1Abe对玉米根萤叶甲没有毒性，Cry3.1Ab对其是有毒性的[17]。特别的是Cry1Ab对鳞翅类昆虫是一种特异性毒素，它的结构域Ⅲ能够提高作用于鞘翅目害虫的特定毒素如Cry3Aa的毒性。已有研究证明转cry3.1Ab基因玉米在防治玉米根萤叶甲方面是有效的[9]。以上研究结果表明，结构域Ⅲ交换对于改善Cry毒素的毒性或利用对害虫不敏感的亲本Cry毒素构建新的混合毒素是应用中有效的方法。对cry基因的3个不同的结构域进行大量的交换[18]，并通过高生物鉴定筛选方法可能为Cry毒素的改善或构建新的毒素提供了新的思路。

1.3结构域Ⅱ和结构域Ⅲ突变

经证明，结构域Ⅱ中裸露的螺旋区域是决定昆虫特异性的重要因素[19]。Cry4Ba对库蚊没有毒性，而 Cry4Aa对其有很强的活性[20]。将Cry4Aa结构域Ⅱ循环3氨基酸序列引入Cry4Bb结构域Ⅱ循环3序列中，该突变体毒素(4BL3GAV)对库蚊产生了毒性，同时对埃及伊蚊的杀虫活性也得到了保留[20]。同样的思路，对鳞翅类Cry1Aa毒素模仿Cry4Bb突变体4BLGAV结构域Ⅱ的螺旋区域进行了设计，使得Cry1Aa(1AaMosq)对尖音库蚊幼虫产生活性，不过活性比4BLGAV低了3倍[21]。以上结果表明，结构域Ⅱ循环区域的交换为提高或改善Cry毒素的特异性提供了一种方法。在某些情况下，结构域Ⅱ循环区域序列的定点诱变使得突变体毒素的杀虫活性增加，第一个例子是循环2结构发生突变的Cry1Ab毒素对舞毒蛾 (Limantriadispar)产生了较高的杀毒活性[22]。单个Cry1Ab循环2的突变体N372A或残留物中一个三重循环2的突变体A282G和L283S能够对舞毒蛾幼虫分别显示出8~36倍的毒性。同时，杀虫活性的提高与舞毒蛾中分离出来的BBMV结合亲和力的增加有关[23]。同样，这也表明Cry3Aa的结构域Ⅱ环区的突变体对鞘翅目昆虫黄粉甲(Tenebriomolitor)的毒性得到了提高[24]。结构域Ⅱ循环Ⅰ区域的三重突变 R345、Y350F、Y351F显示出比 Cry3Aa对黄粉甲高10倍的毒性和对马铃薯甲虫高2倍的毒性，这也与马铃薯甲虫的BBMV高出2倍的结合能力有关[23]。这些结果表明，结构域Ⅱ循环区域是Cry毒素的重要结合区域，为提高毒素的杀虫活性，该区域是进行突变的合适目标。对于2个不同结构域Ⅲ的裸露循环区域的突变，只有几个例子显现出其对不同昆虫种类有温和的毒性，但毒性的增加并不显著[24~27]。然而，已有研究对锚定的结构域Ⅲ抗原与ALP或APN受体的结合研究很少[28~30]。这些结构域Ⅲ的结合区域的诱变可能为Cry毒素杀虫活性的增加提供了理论基础，比如结构域Ⅲ交换已经被运用于构建新的毒素从而提高毒性[14]。

1.4Cry毒素的其他突变

结构域Ⅰ突变除了所熟悉的引入蛋白酶分裂位置之外，对Cry1Ab或Cry2Aa的结构域Ⅰ的改造也可以使杀虫活性得到提高。Cry1Ac螺旋α5突变体V171C对舞毒蛾显示出高达25倍的杀虫活性而不影响其对烟草天蛾幼虫的毒性[30]。Cry1Ac V171C毒性的增加是由于高效的解链速率使得毒素更快的解链而插入膜中[31]。对Cry2Aa而言，结构域Ⅰ的两个改造使得Cry2Aa突变体对斜纹夜蛾(Spodopteralitura)、棉铃虫(Helicoverpaarmigera)和球菜夜蛾(Agrotisipsilon)显示出高达4~6倍的毒性。Cry2Aa的第一个改造包括切除N末端的第一个42氨基酸残基，Cry2Ab结构域Ⅰ螺旋α1前显示第一个49氨基酸，这些残基通常在Cry2Ab蛋白质的蛋白酶激活期间被切除。N末端裸露出参与受体相互作用的封闭结构域Ⅱ的疏水性碎片[32]。因此，N端蛋白质片段的蛋白水解分裂作用可能是避免42氨基酸被切除的一个限速步骤[33]。Cry2Aa螺旋α1的残留物两个额外的突变K63F和K64P是基于提高四氯化硅跨膜运输区域的疏水性原理而提出的[33]。最后，Cry3Aa通过融合一个8氨基酸残基被证明是特异天牛肠羧甲基纤维素酶使得其对光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)有高达3倍的杀虫活性[34]。因此也有研究提出融合肽通过结合肠道纤维素酶来增加肠道的毒素[34]。

2Cry毒素进化的高通量输出技术——噬菌体展示技术

如上所述，在Cry结构域Ⅱ和Ⅲ中通过定点诱变结合抗原从而提高杀虫活性，这对于提高Cry毒素对不同昆虫的活性具有很大的潜力，如不同的Cry毒素改造的例子所示，改造相应的氨基酸区域可以提高毒素的杀虫活性。然而，这些例子的分析结果是从不同种类的昆虫中的几个突变体得到的，而不是高通量输出系统。

据报道，基因转移对于cry基因突变体库的构建是一个有效的方法，能够增加杀虫活性。Lassner等[35]通过Cry1Ca蛋白质演化增加对粘虫的杀虫活性。通过生物检测筛选出改造的 Cry1Ca突变体，这些突变体对烟草蚜虫显示出比亲本Cry1Ca毒素高出5倍的毒性。然而使得Cry1Ca 蛋白质杀虫活性增强的区域还没有明确。在许多变体中选出所需的突变体，这种方法可能会提供更好的Cry突变体毒素。然而，从许多Cry毒素变体中进行筛选时，通过生物检测来识别改造突变体是一项具有挑战性的任务。因此，理想的方法应该是从Cry突变体库中筛选能结合来自靶标昆虫中的BBMV或纯化来自靶标昆虫的受体分子。在最后一种情况下，它需要限制Cry毒素结合区域的诱变，这对于与特定受体分子的结合是很重要的。

2.1噬菌体展示技术

噬菌体展示技术能够快速选择突变体，从而提高结合的特异性[35,36]。此外，外源蛋白DNA序列融合外壳蛋白基因使得融合蛋白在噬菌体的表面展示出来，并可以通过噬菌体与配体相互作用被筛选出来，这一过程叫做生物淘选。通过将目标蛋白质与衣壳蛋白质比如衣壳蛋白质p3 或 p8融合而构建丝状M13噬菌体库。融合蛋白可能被合并为噬菌体基因体或成为分子载体即噬菌体。噬菌体载体包含一个外壳蛋白基因，通常有一个确定的位置进行蛋白质融合，一个氨苄青霉素抗生素作为抗性基因以及利用质粒复制位点在大肠杆菌细胞中复制的能力[36,37]。展示融合蛋白必须通过一个前导肽序列改变主机周质的位置，而辅助噬菌体为噬菌体组装提供了必要的组件。这是一个功能强大的技术，所选的噬菌体在显示蛋白和编码基因之间通过生物淘选的物理链路进一步诱变并选择，该链路允许体外高通过输出蛋白质分子进行演化[38]。

2.2噬菌体最优系统的选择

Cry1A毒素已经在M13和T7等噬菌体中成功表达，然而，对于展示Cry1A毒素来说这些系统并不是最优系统[39~42]。M13噬菌体展示系统在展示时的一个固有问题是大分子蛋白质作为融合蛋白必须运送到大肠杆菌发生噬菌体组装的周质中。Cry1Aa第一次被展示出来是在M13中[39,40]，这显示出在融合毒素蛋白时会发生重要的删减[39]。然而，另一份报告中，Cry1Ac在M13中的展示显示出对烟草蚜虫幼虫的毒性，但同时也显示出Cry1Ac蛋白在体外没有结合APN受体的功能，展示的毒素结构受到约束[40]。之后的结果表明，噬菌体l和T7这两个系统可能是更优的系统，用来显示细菌细胞的细胞质中Cry1A毒素作为噬菌体粒子允许大蛋白质的展示[41,42]。对于噬菌体l，Cry1Ac蛋白质与衣壳蛋白D融合并且在噬菌体粒子表面得到展示。Cry1Ac毒素的展示保留了与野生型毒素相似的对烟草天蛾幼虫的毒性以及与APN受体相互作用的能力[41]。另一个报告显示，Cry1Ac基因能够与T7 10B衣壳蛋白基因的3′端融合，并且嵌合蛋白在T7 噬菌体的表面进行展示。T7-Cry1Ac结合Cry1Ac受体和BBMV来分离烟草天蛾幼虫并保留对烟草天蛾幼虫的毒性，这些结果表明Cry1Ac毒素在T7噬菌体中可以得到成功展示[42]。然而，l和T7系统展示的一个问题是，这两个系统在展示融合蛋白时要依赖体外的包装系统，最好的情况下1 mg DNA允许生产107重组噬菌体粒子，使得突变体库的构建效率低下。

2.3Cry毒素突变体的筛选

尽管某些Cry毒素在噬菌体粒子上显示效率方面存在问题，但通过生物淘选从已经有的噬菌体展示库来选择改造的Cry毒素突变体[43~45]成功的例子已知的至少有3个。第一个例子是利用T7 噬菌体系统来显示Cry1Aa毒素。在结构域Ⅱ循环2区域的突变体库已经建造出来，并用于恢复毒素变体来增加对蚕(Bombyxmori)的钙粘蛋白片段的结合亲和力。使用钙粘蛋白涂磁珠，经过5轮的选择，结构域Ⅱ循环2突变体与钙粘蛋白结合的亲和力有明显的提高，与选中的Cry1Aa相比对蚕幼虫有高达4倍的杀虫活性[43]。另外两个例子是根据基因转移建立Cry毒素变体库，这些变体库在M13上得到显示并且根据生物淘选选出与来自靶标昆虫的BBMV结合的改造突变体。Cry毒素对草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)是有毒性的，但对于甘蔗巨头钻(Telchinlicuslicus)没有毒性[44]。通过基因转移而构建的Cry1Ia突变体库被克隆为噬菌体载体并且在M13噬菌体上显示。从该突变体库选择最好的Cry1Ia并结合甘蔗巨头钻的BBMV，对甘蔗螟有杀虫活性的4个重要的突变体包括结构域Ⅰ和Ⅲ的单个突变被恢复并且得到显示[44]。Cry8Ka基因被认为是一种对棉铃象甲(Anthonomusgrandis)显示中度毒性的毒素，Cry8Ka的基因转移和改造提高了与棉铃象甲BBMV的结合能力，使得突变体(Cry8Ka5)显示出比原毒素高出3倍的毒性，该突变的改造是将一个位于被预测结构域Ⅱ循环3区域氨基酸N端的16个氨基酸删除以及对6个额外氨基酸进行改造[45]。

3展望

随着对Cry毒素作用机制的研究， Cry毒素能够有效地防治农林业中的重要害虫。正如之前指出的，昆虫抗性的出现可能会威胁到其发挥作用。通过对Cry毒素进行分子改造，从而提高其杀虫活性，同时控制不同昆虫目种，如鞘翅目和鳞翅目。了解Cry毒素的作用机制和昆虫对Cry毒素的攻击机制，将有利于新的、更多有效分子改造的Cry毒素的发展。因此，我们可以预见一个光明的未来，利用分子改造的Bt Cry毒素以防治农业生产中的重要害虫，减少对化学杀虫剂的依赖，保持一个更健康的环境。

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Progress on Molecular Modification Methods of Insecticidal Activity of Cry Toxin

GUO Ya-jie1,2, LI Ping1, WU Zhong-ling1, ZHENG Ru-ping1, ZHANG Jun1,2, HU Xia1*

1.ForestryCollege,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China;

2.KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology,MinistryofEducation,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China

Abstract:Cry toxins produced byBacillusthuringiensis(Bt) could provide a valuable resource for efficient pest control. But insect midgut proteases could be a limiting step of Cry toxicity in different insect species. This article analyzed several different strategies of improving toxicity against a specific target, including domain Ⅲ swapping, domain Ⅱ and domain Ⅲ mutations and other mutations in Cry toxins. Furthermore, this article also expounded the phage display to optimize toxin, which improved the insecticidal toxicity against pests that show no susceptibility to the parental Cry toxins. The paper was expected to provide reference for molecular modification and application of Cry toxin.

Key words:Bacillusthuringiensis; cry toxin; evolution; molecular modification

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.01.05

作者简介：郭雅洁，本科生，主要从事微生物农药研究。E-mail：924327611@qq.com。*通信作者：胡霞，讲师，主要从事昆虫与微生物的互作关系研究。E-mail：lake-autumn@163.com

基金项目：国家大学生创新创业计划项目(201510389018);福建农林大学重点项目建设专项(6112C035005)资助。

收稿日期：2015-11-24; 接受日期：2015-11-26