细菌冷激蛋白研究进展

金　鑫,　范海丽,　陈建丽,　黄天培,　关　雄

福建农林大学, 闽台特色作物病虫生态防控协同创新中心, 教育部生物农药与化学重点实验室, 福州 350002



细菌冷激蛋白研究进展

金鑫,范海丽,陈建丽,黄天培*,关雄

福建农林大学, 闽台特色作物病虫生态防控协同创新中心, 教育部生物农药与化学重点实验室, 福州 350002

摘要：冷激蛋白(cold shock protein, CSPs)是微生物受到冷刺激所诱导合成的分子量为7 kDa左右的蛋白质,它们与细胞在低温环境下的应激反应密切相关。冷激蛋白的功能是作为RNA的分子伴侣与mRNA结合，阻止mRNA二级结构的形成，从而使翻译顺利进行。主要介绍了细菌冷激蛋白的功能、应用以及调控机制的研究进展，以期为更深入的生产应用和功能等的科学研究提供参考。

关键词：冷激蛋白；功能；调控机制

对于微生物而言，当环境温度明显低于其正常的生理温度时，会产生瞬时的冷诱导反应，影响细胞的生长速率、饱和脂肪酸的利用率以及DNA、RNA和蛋白质合成。当温度骤然降低时，大多数蛋白质的合成受到抑制，然而冷诱导蛋白(cold induced proteins, CIPs)会急剧增加。其中一些小分子量(大约7.5 kDa)的酸性蛋白质被强烈诱导产生,称之为冷激蛋白(CSPs)[1]。这些蛋白对于细胞在适应低温环境和发挥各种功能是极为重要的。这意味着对CSPs的研究具有广泛且可观的应用价值。比如，乳酸菌作为食品工业中十分重要的菌株，许多乳酸发酵剂都需要添加冷冻的培养物，这对菌株的冻藏存活率有很高的要求，因此增强菌株抗冻能力的研究正在兴起，对CSPs作用机制的研究则具有重大意义[2]。

1冷激蛋白的分布

CSPs的分布十分广泛[3]，在细菌中最早研究发现的是大肠杆菌(Escherichiacoli)中的CspA，当大肠杆菌从37℃降到10℃培养时，蛋白质合成的数量大幅度减少，细胞停止生长。2 h后，只有28种蛋白明显产生，其中有14种蛋白表达量高于处理前。冷刺激3 h后，一些蛋白的表达量开始增加，直至4 h后，蛋白的表达恢复正常。CspA是冷激后首先被诱导产生的蛋白，也是唯一在37℃检测不到的蛋白[4]。随后在大肠杆菌中发现了8种与CspA具有同源性的蛋白(CspB~CspI),其中只有CspA、CspB、CspE、CspG和CspI是低温诱导产生的，CspC与细胞的生长调控有关，基本在37℃表达，而CspD则在稳定期和营养缺乏时才会产生[5]。

与大肠杆菌不同，枯草杆菌(Bacillussubtilis)受到冷激后不会出现生长的停止，而是生长速率变得很慢。当枯草杆菌从37℃降到15℃培养时，在30~60 s内有36种蛋白质能够被合成，经鉴定，其中含有一个同源的酸性小蛋白家族(CspB、CspC和CspD)，其同源性大于70%，而CspA不是其成员，此时CspB成为枯草杆菌中主要的冷激蛋白[6]。CspB一般在低于20℃培养时才存在，但不表示在细胞正常生长时不表达，因为当枯草杆菌从生长指数期进入到稳定期后，蛋白质的合成方式会产生明显的变化，此时，CspB和CspC这两种同源的酸性小蛋白质能被诱导产生，而CspD没有产生[7]。这与大肠杆菌相比显然是不同的。

嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)在20℃培养2~4 h后，CSPs的表达水平会增加3~4倍，将温度下调至10℃培养，基本没有CSPs的产生，这说明10℃是嗜热链球菌耐受的最低温度。嗜热链球菌中最主要的CSPs是CspA，当细菌从42℃转到20℃培养后,CspA的表达量会增加3倍左右，CspB、CspC、CspE等虽然都有表达，但表达量远不如CspA[8]。

除了大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，李斯特菌(Listeria)、根瘤菌(Rhizobium)[4]、沙门氏杆菌(Salmonellaentericaserovarcyphimurium)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)[9]等均证实有CIPs的存在。

2冷激蛋白的功能

2.1冷激蛋白作为分子伴侣的功能

目前，对冷激蛋白的功能研究比较有限，普遍认为其功能是作为RNA分子伴侣与mRNA结合，起到稳定mRNA的作用，促进翻译顺利进行。研究表明，将枯草杆菌的cspB基因敲除会对15种冷诱导蛋白的产生造成消极影响，这表明，CspB在受到冷刺激后能够产生一种调节功能。敲除CspC和CspD基因并不会引起太大的表型变化，若将CspB、CspC、CspD3个基因敲除，只有将3基因缺失突变体重组到一个未缺失CspB的质粒载体上，突变体才会重新生长[7]。这说明CspB对于细菌在低温环境中的生存是十分重要的。在大肠杆菌CSPs家族中，只有CspA、CspB、CspG和CspI是冷诱导产生的。在指数生长前期，CspA的含量约50 μmol/L，虽然此时cspA基因的转录水平较高，但其mRNA稳定性较差，并且容易发生降解；而在低温条件下其mRNA稳定性则很好。CspA、CspC和CspE有消除RNA二级结构的作用，可能具有抗终止子的作用[10]。CspD的表达量在细胞生长进入稳定期或是营养缺乏时就会增加，是细胞在该环境条件下生长必需的蛋白。低温条件下，亲水的mRNA会发生折叠，影响翻译进程，而CspB的存在则能够阻止mRNA二级结构的形成，使翻译顺利进行[11]。CspF和CspH目前只知道其不是冷诱导的,与其他冷激蛋白结构明显不同，但其功能未知；CspI功能也未知。

2.2冷激蛋白的生理功能及应用

冷激蛋白的生理功能具有多样性。近年来国内外学者针对冷激蛋白的应激应用有较多研究。将戈壁异常球菌(Deinococcusgobiensis)I-0的Csp1基因导入到大肠杆菌Trans 109中表达，能提高大肠杆菌对低温、高盐、干旱等逆境的适应性[12]。将耐辐射异常球菌(DeinnoccusradioduransDR1)中编码冷激蛋白Csp2的基因转入到甘蓝型油菜中，能提高甘蓝型油菜种子抵御干旱胁迫的能力[13]。将枯草芽孢杆菌XS-01的CspB基因转入烟草中，得到干旱胁迫后恢复力显著增强的转基因烟草[14]。孟山都公司将大肠杆菌的cspA基因和枯草芽孢杆菌的cspB基因转入到拟南芥中，得到了抗寒能力显著增强的转基因品系；将cspA和cspB基因转入到水稻中，得到了对低温、高温、干旱等对逆境胁迫的耐受能力显著提高的转基因水稻；将cspB基因转入到玉米中，在2009-2011年的田间试验中，缺水条件下这种转基因玉米较传统品种产量增加了6%[15,16]。

3冷激蛋白的调控机制

3.1mRNA稳定性

大肠杆菌CspA的mRNA存在一个长150 bp的5′非翻译区(5′-UTR)，对mRNA的稳定性有着重要的影响，大肠杆菌的CspA在温度骤降之后的2 h内可以瞬时表达。其中，CspA mRNA的5′-UTR在CspA的表达调控中起着关键性的作用。37℃时mRNA半衰期极短且不稳定，对CspA的表达产生了消极影响，当培养温度由37℃降到15℃时，半衰期暂时延长，mRNA折叠量增加，稳定性升高[17]。将5′-UTR内3个碱基替换掉会导致CspA的mRNA稳定性在37℃提高150倍，这可以说明CspA的启动子在37℃时是比较活跃的，推测认为这种稳定性的增加可能是由于其对RNase的降解产生了抗性[18]。

3.2冷框

进一步研究发现CSPs 5′-UTR中有一段长为11个核苷酸的保守序列，称其为冷框(cold box)，冷框的存在可以增强CspA mRNA的稳定性，促进冷激蛋白的表达，若将冷框敲除则会导致mRNA稳定性显著降低，CspA的表达受到抑制，这说明冷框在CIPs的转录水平起到重要的调控作用。冷框的作用主要取决于其茎环结构中茎部的完整程度，这个片段的缩短、缺失或突变都会导致CspA的表达量明显下降。其茎环后方AU序列的缺失会使CspA mRNA的稳定性增强，半衰期延长，造成这一现象可能的原因是此区域含有RNaseE的酶切位点。研究表明，CspA的mRNA与核糖体的结合位点即为冷框，当冷框过量表达时，可与核糖体结合，使低温条件下CspA mRNA的5′-UTR与核糖体有很强的亲和性并优先表达[19,20]。

3.3CSPs自身

通常核苷酸二级结构的形成，会阻止转录的进行,从而影响翻译，而CSPs作为RNA分子伴侣，能与处于单链状态的RNA或DNA结合，具有消除核苷酸二级结构的作用，保证转录的顺利进行，起到调节表达的作用。

3.4DB框

Csps除了消除mRNA的二级结构、促进蛋白翻译，还存在其他增强自身翻译的机制，如大肠杆菌的CspA存在另一种增强其自身翻译的机制：在CspA的mRNA上存在一个顺式作用元件DB框(down stream)，它是一个位于翻译起始密码子下游12 bp处的一段长14 bp的保守序列，可以与16S rRNA的一段序列互补，增强SD序列与核糖体的结合，它对消除细胞冷刺激后翻译受到的抑制起关键作用，在DB框的帮助下，CspA的mRNA翻译可能不需要冷诱导特异的核糖体因子(如CsdA和RbfA)参与就可以完成[21]。

4展望

大量研究证实,冷激蛋白的重要功能在于其能减轻温度骤降对微生物伤害，对微生物适应低温生长环境起着关键作用，目前对于其结构研究的比较彻底，而对于温度的敏感性、冷激蛋白确切的生理作用和冷诱导的调控以及与其他环境刺激的交互作用仍需进一步深入研究。研究表明，冷激蛋白的生理功能具有多样性，将冷激蛋白的冷激基因用于生物体性状改良，能提高菌株及作物对低温、高温、干旱等逆境的适应性，体现了冷激蛋白和冷激基因广泛的实际应用潜力，也间接证明了冷激蛋白在食品、农产品和生物资源等方面具有极高的应用价值。

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Progress on Bacterial Cold Shock Proteins

JIN Xin, FAN Hai-li, CHEN Jian-li, HUANG Tian-pei*, GUAN Xiong

KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology,MinistryofEducation,Fujian-TaiwanJointCenterforEcologicalControlofCropPests,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China

Abstract:Cold shock proteins (CSPs) is the 7 kDa small protein that bacteria responsing to low temperature. CSPs is closely related to cell cold response. CSPs may function as RNA chaperones, as they possess binding mRNA. In this way they could minimize the secondary folding of mRNA, thereby facilitating the translation process. This article reviewed the function, application and mechanism of regulation of CSPs, which was expected to provide reference for further study on the application and function of CSPs.

Key words:cold shock protein; function; regulation

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.01.03

作者简介：金鑫，硕士研究生，主要从事微生物药物方面研究。E-mail：jinqiaoyi1215@163.com。*通信作者：黄天培，副研究员，硕士生导师，主要从事微生物药物方面研究。E-mail：tianpeihuang@fafu.edu.cn

基金项目：国家863计划项目(2011AA10A203);福建省2011年协同创新中心资助项目(闽教科[2013]51号);高校领军人才项目(k8012012a)资助。

收稿日期：2015-10-29; 接受日期：2015-12-02