蝇蛆壳提取壳聚糖的综合评价

垢德双 闵昌敏

300191天津市医疗器械技术审评中心

蝇蛆壳提取壳聚糖的综合评价

垢德双 闵昌敏

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目的壳聚糖具有良好的水溶性、生物相容性、生物降解性、成膜性及止血、愈创、消炎等作用，在医用生物材料应用方面具有广阔前景。蝇蛆的皮中含有大量壳聚糖成分，是获得较纯壳聚糖的方式之一。对蝇蛆提取的壳聚糖创伤敷料进行综合评价。方法按照国家统一标准对蝇蛆壳聚糖进行理化分析（相对分子质量、脱乙酰度和重金属含量）、抑菌、皮肤致敏、细胞毒性和溶血实验。结果蝇蛆壳聚糖的相对分子质量为266 ku，脱乙酰度为75%，重金属含量小于10-5，细胞毒性总评级为1级，具有较轻细胞毒性。致敏和溶血实验结果表明，蝇蛆壳聚糖材料不具有致敏反应，材料的溶血率为0.769%，小于5%，即没有溶血现象。此外，蝇蛆壳聚糖还具有抑菌作用。结论蝇蛆壳聚糖具有较好的综合特性，可以满足生物医药方面的要求。

壳聚糖；蝇蛆；生物学评价

0 引言

出血与渗血是目前外科手术中常见的难题。近年来，优秀的可吸收医用止血材料引起了医学界和产业界的广泛关注。随着临床对止血材料性能要求的不断提高，开发可降解、无刺激及无毒副作用的止血材料是亟需解决的问题。目前常用的止血材料可分为天然材料（如胶原、壳聚糖和海藻酸钠），合成材料（如聚氨酯、聚乙烯醇）和复合材料（如将纤维蛋白原、凝血酶等复合在壳聚糖、氧化多糖等天然材料上制成止血绷带等）[1]。近年来，壳聚糖因具有止血效果好[2-3]、生物相容性高[4]等特点，成为止血材料的研究热点之一。

壳聚糖是天然获取的，无毒性的高分子多糖材料[5]，广泛应用于工业、农业及医药等领域。在医药领域主要用于止血、抗菌消炎和促进伤口愈合[6-9]。在自然界中，壳聚糖分布十分广泛，在菌类、藻类植物等细胞以及虾、蟹外壳中含量较高。此外，壳聚糖在昆虫的外壳中含量也比较高，如蝇蛆外壳。目前，壳聚糖的工业提取主要来源于废弃的虾、蟹壳。由于水污染及虾、蟹过量打捞等原因，使得壳聚糖的纯度和品质难以得到满足。此外，虾、蟹壳中含有大量的石灰质及蜡质，壳聚糖的含量低，生产工艺较复杂，成本较高。而家蝇属于再生资源，且苍蝇的繁殖能力很强，1对苍蝇4个月可繁殖2 660亿个蝇蛆。干蛆皮中壳聚糖含量约为30%~55%，高于虾、蟹中壳聚糖的含量，因此具有可利用价值。除了壳聚糖的含量高以外，蝇蛆壳中石灰石及蜡质含量相对较低，且碳酸盐和重金属含量低，色素少，因此蝇蛆壳是提取甲壳素的极好原料。

本研究以蝇蛆壳提取的壳聚糖为研究对象，依照国家对医疗器械的规定，对来源于蝇蛆壳的壳聚糖粉进行物理、化学以及生物安全性评价。实验结果有助于预测临床试验中可能出现的不良反应，为下一步临床试验提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

蝇蛆壳聚糖粉（天津普生元医疗科技发展有限公司），RPMI1640培养基、小牛血清和相关试剂耗材（美国Gibco公司），L929细胞（中国医学科学院细胞库）。选取30只2月龄豚鼠（清洁级），雌雄各半，无皮肤疾病或者皮肤损伤，平均体质量为350 g（中国医学科学院放射医学研究所）。

IVS600-4S全自动乌氏黏度仪（杭州中旺科技有限公司），SM800多功能酶标仪（上海永创医疗器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 相对分子质量测定

精确称取0.05 g恒重样品加至0.1 mol/L NaCl溶液中充分搅拌混合均匀。取15.0 ml样品溶液置于乌式黏度计中，在30℃恒温水浴中放置10min，并用秒表分别测定溶剂和样品溶液的流出时间，重复5次取其平均值。利用公式（1）计算样品的黏均分子量

式中：η为特性黏度，相对黏度ηr=T/T0，增比黏度ηsp=ηr-1，C为样品溶液的质量浓度（g/ml），T为溶液的流出时间，T0为纯溶剂的流出时间。

用黏度方程[η]=7.92×10-5M1.00计算黏均分子量。

1.2.2 脱乙酰度测定

采用双突跃电位滴定法。准确称取蝇蛆壳聚糖样品0.5 g，加入0.1 mol/L盐酸至过量，均匀缓慢搅拌至样品完全溶解。用NaOH标准溶液滴定样品溶液，准确记录突跃点前后的NaOH标准溶液体积差，计算脱乙酰度

式中：ΔV为两个突跃点消耗的NaOH溶液体积之差（ml），CNaOH为氢氧化钠标准溶液浓度（mol/L），m为样品质量。

1.2.3 重金属含量

按照中国药典（2005版）标准方法测量。取样品，炽灼处理后取遗留的残渣，加硝酸蒸干，向残渣中加入盐酸，水浴蒸干后再加水。向溶液中滴加氨溶液至酚酞指示液出现粉红色，再向溶液中加入醋酸盐缓冲液，稍微加至完全没有沉淀，将样品转移至纳氏比色管中，加入蒸馏水稀释至25 ml，将该处理液作为甲管；另取加标准铅溶液作为乙管。向甲、乙两管中分别加入2 ml硫代乙酰胺溶液，摇动混匀，放置2 min后置于白纸上仔细观察，比较两管颜色，进行重金属含量检查。

1.2.4 体外细胞毒性实验

依据国家GB/T14233.2-2005标准进行蝇蛆壳聚糖样品的细胞毒性试验[10]，用含血清培养基浸提实验样品[11]，样品的质量浓度为0.1 g/ml；使用RPMI1640培养基作为空白对照组；高密度聚乙烯作为阴性对照组；5 g/L的苯酚溶液作为阳性对照组。将对数生长期L929细胞用胰酶消化后制成细胞悬液，将悬液置于5%的CO2培养箱中培养24 h，待细胞完全贴壁后弃去原培养液。样品组加入蝇蛆壳聚糖浸提液，放置于5%的CO2培养箱中培养。培养3 d后加入噻唑蓝（MTT）溶液，继续培养4 h，加入二甲基亚砜（DMSO）。将溶液震荡混匀后放入酶标仪中，在570 nm波长下测定其溶液的吸光度（OD）值。计算相对增殖率（relative proliferation tate,RGR）

样品毒性分级标准：0级≥100；1级，80~99；2级，50~79；3级，30~49；4级，1~29；5级，0。样品合格与否标准：0级和1级判为合格，2级结合形态分析综合评价，3~5级判为不合格。

1.2.5 致敏实验

依据国家GB/T16886.10标准第七章“最大剂量法”进行检测[12]。实验分3组，浸提液组，生理盐水组和甲醛组，每组随机分10只豚鼠。豚鼠腹部剃毛，在去毛区域注射材料浸提液。阴性对照液为生理盐水，阳性对照液为甲醛。将浸透材料浸提液和阴、阳性对照液的纱布敷贴于腹部，封闭固定24 h。分别在24和48 h观察激发部位的皮肤反应情况。

1.2.6 溶血实验

阳性对照组为生理盐水；阴性对照组使用蒸馏水；实验组使用蝇蛆壳聚糖生理盐水浸提液。分别放入37℃水浴中保温，加入稀释抗凝兔血，轻轻混匀。继续在37℃恒温水浴中保温60 min。水浴结束后倒出管内液体，离心后吸取上清液置于紫外分光光度计比色皿中，在545 nm处测量OD值。计算溶血率

1.2.7 抑菌能力的测定

选取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念球菌作为初始菌悬液。实验方法按照《消毒技术规范》（2012年版）执行。

1.3 统计学方法

采用SPSS15.0统计学软件进行统计分析，数据以均值±标准差（x±s）表示，实验结果进行方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

牛超担任“正阳牛”打药队队长后，坚持“诚信服务，创新优先和农机农艺农技三结合、良田良种良法三配套、效果效益效率三兼顾”的经营原则，走村串户发名片，开通植保服务咨询热线，为了宣传植保服务效果，每个村庄选择两户人家，打药不要钱，让农户见证植保效果。此外，他们还免费为困难的留守老人提供植保服务。

2 结果

2.1 蝇蛆壳聚糖理化性质

蝇蛆壳聚糖的相对分子质量为266 ku，脱乙酰度为75%，重金属含量为6×10-6。

2.2 细胞毒性实验

实验结果显示，阴性对照组与空白对照组的细胞数目没有明显差别（P＞0.05），均能很好地贴壁生长。阳性对照组的细胞为悬浮死亡细胞，细胞不贴壁。实验组有很少量细胞溶解，能很好地贴壁生长，细胞的增殖率为（83±5.5）%。细胞毒性实验结果说明，蝇蛆壳聚糖具有较轻的细胞毒性。阴性对照组、空白对照组和实验组的RGR均远高于阳性对照组（P＜0.000 1）。（图1）

图1 蝇蛆壳聚糖的细胞毒性试验结果

2.3 致敏实验

致敏实验结果显示：24和48 h后，蝇蛆壳聚糖浸提液组和生理盐水组实验动物皮肤均无异常反应、水肿和红斑现象；甲醛实验组现象明显，实验动物皮肤出现严重红斑水肿。依据Magnusson和Kligman分级标准，蝇蛆壳聚糖致敏等级为0级，即蝇蛆壳聚糖无致敏毒性。

溶血实验结果显示，蝇蛆壳聚糖的溶血率为（0.769±0.061）%，低于5%，即蝇蛆壳聚糖不存在溶血毒性。

2.5 抑菌活性分析

在19～21℃条件下，用质量浓度为25 g/L的本品糊状物作用2 min，对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的平均抑菌率为95%，对白色念球菌平均抑菌率为83%。

3 讨论与结论

壳聚糖材料使红细胞发生凝集反应、促进血液中血小板和其他补体系统激活，最终来实现伤口止血。作用机制主要有：①壳聚糖分子能携带大量阳离子，所带的正电荷可以和血液中红细胞表面带负电荷的物质发生相互吸引，有助于伤口形成血凝块，起到止血目的。此外，壳聚糖大分子物质可以在血液中发生聚合反应形成立体网状结构，后者能截取血液中红细胞并促使其聚集。②当外源性异物透过伤口进入人体后可活化血液中的血小板，在血小板表面生成带负电性物质，该物质能与壳聚糖分子上所吸引的正电荷相互吸引，引发聚集，迅速形成血凝块。此外，在血液补体系统活化过程中，壳聚糖大分子链上游离的大量氨基和羟基基团还可再发挥作用，帮助血液凝集[13]。

脱乙酰度和相对分子质量是壳聚糖的重要参数。目前市场上壳聚糖材料的相对分子质量分布很广，从十万到上百万都有销售，不同产品的黏度差别也很大。脱乙酰度是很关键的因素，如果脱乙酰度不高，则该材料不能直接使用，还需要再次脱乙酰基团直至达70%以上。此外，对壳聚糖材料还要进行适当的降解处理，只有获得中低相对分子质量和黏度的壳聚糖，才能促进伤口的止血和愈合。测定脱乙酰度的方法有红外光谱法、电位滴定法、酸碱中和滴定法、胶体滴定法及紫外光谱法等。其中，酸碱滴定法最简便快速，成本低廉，使用最为广泛，但需要指示剂，实验中会造成误差。因此尽量不要选择甲基橙作为指示剂。

本实验结果显示，蝇蛆壳聚糖材料具有无细胞毒性、无溶血及致敏现象，且生物相容性良好，满足国家相关医疗器械标准的基本要求，是优异的医用敷料及组织工程材料。但是，由于单纯壳聚糖成分很难完全满足临床医学的发展要求，因此，对壳聚糖进行材料改性或复合其他高分子材料是今后壳聚糖敷料研究的热点和发展方向。目前，很多高分子材料都可以与壳聚糖材料复合，如聚乙烯醇[14]、聚乙二醇[15]、聚乙烯基吡咯烷酮[16]、聚环氧乙烷[17-18]、胶原和明胶[19]、海藻酸盐[20]和玉米淀粉等等[21]。此外，壳聚糖纳米材料在组织工程中有广泛应用[22]，以壳聚糖与胶原的复合材料制成的药物释放体系也取得了很好的效果[23]。综上所述，以蝇蛆为原料提取的壳聚糖具有很好的生物安全性，有广泛的应用前景。

利益冲突无

[1]邓乐君,樊鸿浩,李伟达,等．可吸收止血材料的生物相容性研究进展[J]．中国生物医学工程学报,2016,35(2)：241-246．DOI：10.3969/j.issn.0258-8021.2016.02.016. Deng LJ,Fan HH,Li WD,et al.Progress in the study on biocompatibilityofabsorbablehemostaticmaterials[J].ChinJBiomed Eng,2016, 35(2)：241-246.DOI：10.3969/j.issn.0258-8021.2016.02.016.

[2]Kang PL,Chang SJ,Manousakas I,et al.Development and assessment of hemostasis chitosan dressings[J].Carbohydr Polym,2011, 85(3)：565-570.DOI：10.1016/j.carbpol.2011.03.015.

[3]Valentine R,Athanasiadis T,Moratti S,et al.The efficacy of a novel chitosan gel on hemostasis after endoscopic sinus surgery in a sheep model of chronic rhinosinusitis[J].Am J Rhinol Allergy,2009,23(1)：71-75.DOI：10.2500/ajra.2009.23.3266.

[4]Kim H,Tator CH,Shoichet MS.Chitosan implants in the rat spinal cord：biocompatibility and biodegradation[J].J Biomed Mater Res A, 2011,97(4)：395-404.DOI：10.1002/jbm.a.33070.

[5]蒋玉燕,毕忆群,房国坚,等．壳聚糖纳米混悬剂的研制和表征[J]．中国组织工程研究与临床康复，2008,12(14)：2628-2630．Jiang YY,Bi YQ,Fang GJ,et al.Preparation and characteristics of chitosan nanosuspensions[J].J Clin Rehab Tissue Eng Res,2008, 12(14)：2628-2630.

[6]Peng Y,Han B,Liu W,et al.Preparation and antimicrobial activity of hydroxypropyl chitosan[J].Carbohydr Res,2005,340(11)：1846-1851.DOI：10.1016/j.carres.2005.05.009.

[7]蒋玉燕,毕忆群,汪子伟,等.聚氨基葡萄糖的体外抗菌活性[J].中国抗生素杂志,1996,21(1)：54-56. Jiang YY,Bi YQ,Wang ZW,et al.The character of antibacterial activity of poly amino glucose[J].Chin J Antibiotics,1996,21(1)：54-56.

[8]蒋玉燕,毕忆群,蒋建国．壳聚糖生物流体敷料膜对各类创面愈合的临床效应[J]．中国组织工程研究与临床康复，2007,11(1)：164-166．DOI：10.3321/j.issn：1673-8225.2007.01.047. Jiang YY,Bi YQ,Jiang JG.Clinical effect of chitosan biological fluid dressing on the healing of various wounds[J].J Clin Rehab TissueEngRes,2007,11(1)：164-166.DOI：10.3321/j.issn：1673-8225. 2007.01.047.

[9]Khor E,LimLY.Implantable applications of chitin and chitosan[J]. Biomaterials,2003,24(13)：2339-2349.

[10]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学实验方法[S].北京：中国标准出版社，2005. State Administration of quality supervision and inspection of the people's Republic of China.GB/T14233.2-2005 Examination method for medical transfusion,blood transfusion and injection apparatus. Part 2：Biological experimental methods[S].Beijing：Standards Press of China,2005.

[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品配制和参照样品[S].北京：中国标准出版社，2000. State Administration of quality supervision and inspection of the people'sRepublicofChina.GB/T16886.12-2000Biological evaluation of medical devices.Part 12：Sample preparation and reference sample[S].Beijing：Standards Press of China,2000.

[12]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T16886.10-2005医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应[S].北京：中国标准出版社，2005. State Administration of quality supervision and inspection of the people'sRepublicofChina.GB/T16886.10-2005Biologicalevaluation of medical devices.Part 10：Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity.Beijing：Standards Press of China,2005.

[13]卢斌,钱利强,章志量．壳聚糖止血机理及应用进展研究[J]．健康研究，2010,30(1)：55-58．Lu B,Qian LQ,Zhang ZL.Hemostatic mechanism of Chitosan and the progress of its application[J].Health Res,2010,30(1)：55-58.

[14]Yu HJ,Xu XY,Chen XS,et al.Medicated wound dressings based on poly(vinyl alcohol)/poly(N-vinyl pyrrolidone)/chitosan hydrogels[J].J Appl Polym Sci,2006,101(4)：2453-2463.DOI：10.1002/app.23344. [15]Zhang M,Li XH,Gong YD,et al.Properties and biocompatibility of chitosan films modified by blending with PEG[J].Biomaterials,2002, 23(13)：2641-2648.DOI：.

[16]Nho YC,Park KR.Preparation and properties of PVA/PVP hydrogels containing chitosan by radiation[J].J Appl Polym Sci,2002,85 (8)：1787-1794.D OI：10.1002/app.10812

[17]Kim IY,Yoo MK,Kim BC,et al.Preparation of semi-interpenetrating polymer networks composed of chitosan and poloxamer[J].Int J Biol Macromol,2006,38(1)：51-58.DOI：10.1016/j.ijbiomac.2005.12. 020.

[18]Kim MS,Choi YJ,Noh I,et al.Synthesis and characterization of in situ chitosan-based hydrogel via grafting of carboxyethyl acrylate[J]. J Biomed Mater Res A,2007,83(3)：674-682.DOI：10.1002/jbm.a. 31278.

[19]Chen JP,Chang GY,Chen JK.Electrospun collagen/chitosan nanofibrous membrane as wound dressing[J].Colloids Surf A Physicochem Eng Asp,2008,313(SI)：183-188.DOI：10.1016/j.colsurfa. 2007.04.129.

[20]Pei HN,Chen XG,Li Y,et al.Characterization and ornidazole release in vitro of a novel composite film prepared with chitosan/poly (vinyl alcohol)/alginate[J].J Biomed Mater Res A,2008,85(2)：566-572.DOI：10.1002/jbm.a.31223.

[21]Wittaya-Areekul S,Prahsarn C.Development and in vitro evaluation of chitosan-polysaccharides composite wound dressings[J].Int J Pharm,2006,313(1/2)：123-128.DOI：10.1016/j.ijpharm.2006.01.027.

[22]陈钟,戴新征.壳聚糖及其纳米粒子在组织工程中的应用[J].国际生物医学工程杂志,2006,29(1)：48-52. Chen Z,Dai XZ.Application of chitosan and chitosan nanoparticles in tissue engineering[J].Int J Biomed Eng,2006,29(1)：48-52.

[23]陈红丽,陈汉,莫丽都尔,等.胶原-壳聚糖载硫酸长春新碱微球缓释药膜的研究[J].国际生物医学工程杂志,2006,29(4)：193-196. Chen HL,Chen H,Moldir,et al.Preparation and characteristics of collagen-chitosan complex film with embedded PLGA microspheres [J].Int J Biomed Eng,2006,29(4)：193-196.

Evaluation of the chitosan from flies maggots shell

Gou Deshuang,Min Changmin
Center for Medical Device Evaluation of Tianjin,Tianjin 300191,China

ObjectiveChitosan has been widely studied in the fields of biomedical materials and tissue engineering,due to its good water solubility,biocompatibility,biodegradability,film-forming property,hemostasis, wound healing and anti-inflammatory effects.Flies maggot shell contains much chitosan,which is one of the excellent raw materials.The aim of this study is to provide integral biological assessment on chitosan trauma dressing.Methods Chitosan samples were subjected to physicochemical analysis(relative molecular mass,degree of deacetylation,and content of heavy metal),bacteriostatic test,skin sensitization,cytotoxicity tests as well as hemolysis test according to national standard of China.ResultsThe relative molecular mass of chitosan was 266 ku,the degree of deacetylation of chitosan was 75%,and the content of heavy metal was less than 10-5.The cytotoxicity level was evaluated at the first level which indicating the low cell toxicity.Skin sensitization test showed that no sensitization reaction was practically detected.The hemolysis rate was 0.769%,which was less than 5%,indicating zero hemolysis. ConclusionsChitosan has good character,which may meet the requirements of biological and medical application.

Chitosan;Flies maggot;Biological assessment

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．03．011

2016-02-16）