载磁性氧化铁CA-PLGA纳米颗粒对宫颈癌细胞的影响

张宏遒 曾小伟 梅林

100084北京，清华大学生命科学学院（张宏遒）；518055深圳，清华大学深圳研究生院（张宏遒、曾小伟、梅林）

载磁性氧化铁CA-PLGA纳米颗粒对宫颈癌细胞的影响

张宏遒 曾小伟 梅林

100084北京，清华大学生命科学学院（张宏遒）；518055深圳，清华大学深圳研究生院（张宏遒、曾小伟、梅林）

目的研究纳米四氧化三铁（Fe3O4）颗粒包裹不同外壳材料对宫颈癌细胞HeLa毒性的影响。方法通过无溶剂热分解法制备磁性纳米Fe3O4颗粒并分别使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和胆酸（CA）修饰的PLGA（CA-PLGA）星型共聚物包裹，对其进行验证表征后，使用激光共聚焦显微镜观察HeLa细胞对纳米颗粒的摄取，并用噻唑蓝（MTT）法测定上述两种材料包裹的纳米Fe3O4颗粒对HeLa细胞的毒性作用。结果制备的单个纳米Fe3O4颗粒粒径约7 nm，载Fe3O4的PLGA和CA-PLGA纳米颗粒均呈球状，粒径约200 nm，理论载药量为10%。当Fe3O4纳米颗粒的质量浓度相同（25 μg/ml）时，载Fe3O4的CA-PLGA纳米颗粒对HeLa细胞的毒性小于对应的PLGA纳米颗粒。结论CA-PLGA星型共聚物可降低磁性纳米Fe3O4颗粒的细胞毒性，在生物体内具有广阔的应用前景。

星型共聚物；氧化铁；纳米颗粒；细胞毒性

Fund program:General Program of National Natural Science Foundation of China(31270019);Guangdong Natural Science Funds for Distinguished Young Scholar(2014A030306036);Science and Technology Planning Project of Guangdong Province(2016A020217001);Science,Technology＆Innovation Commission of Shenzhen Municipality(JCYJ20150430163009479,JCYJ20150529164918738)

0 引言

近年来，纳米材料的研究得到了科学界的广泛关注。所谓纳米材料，是指由粒径在1~100 nm的纳米颗粒所组成的材料。因其粒径不同于普通材料，故会表现出许多特殊的优越性质，从而被广泛用于各个领域[1]。纳米氧化铁颗粒就是一种非常典型的生物学材料，该材料生物毒性小，颗粒粒径易被控制。其中，纳米四氧化三铁（Fe3O4）颗粒除具有上述特性外，还具有磁性特性，因而被广泛应用于工业领域。近年来，随着磁共振技术（magnetic resonance imaging,MRI）的逐渐普及，磁性纳米Fe3O4颗粒在生物学领域的重要价值也逐渐被发掘。由于磁性纳米Fe3O4颗粒比表面积大，所以很容易聚合而影响效果，因此笔者使用高生物相容性大分子来包裹纳米Fe3O4颗粒。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly（laticco-glycolic acid）,PLGA）是非常流行的一种生物相容性好、体内稳定性高的大分子材料。Zeng等[2]对PLGA进行了胆酸（cholic acid,CA）修饰，形成了CA-PLGA星型共聚物，且后者的细胞摄取效率更高。因此笔者尝试使用CA-PLGA对纳米Fe3O4材料进行包裹，对其表征并检测其细胞摄取效果。在细胞摄取方面，细胞毒性是必须要考虑的问题，也是决定材料是否具有广泛应用前景的重要方面[3]。笔者拟采用噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）法测定载Fe3O4的CA-PLGA纳米颗粒对宫颈癌细胞HeLa的毒性。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

乙酰丙酮铁、90%油酸（美国Sigma-Aldrich公司），曲拉通X-100（Triton X-100）（美国Amresco公司），70%油胺、PLGA、四氢呋喃（中国药物总公司），再生纤维素透析袋（截留相对分子质量为5 000 u）（美国光谱医学公司），宫颈癌HeLa细胞系（美国ATCC）。

Nicolet 6700傅里叶红外光谱仪（美国Thermo Fisher公司），ACF300核磁共振分析仪（德国Bruker公司），Waters2414凝胶渗透色谱仪（美国Waters Milford公司），Q500热重分析仪（美国TA公司），μSpeed-S10激光多普勒测速仪（德国Elovis公司），ZS90纳米激光粒度仪（英国马尔文公司），Tecnai G2 F20透射电子显微镜（荷兰FEI公司），FV1200激光共聚焦显微镜（日本奥林巴斯公司）

1.2 方法

1.2.1 纳米Fe3O4颗粒的合成和表征

纳米Fe3O4颗粒的合成方法如文献[4]所示，具体步骤为：将700 mg的乙酰丙酮铁与10 ml油酸及10 ml油胺混合形成悬浊液，在氩气流的保护下，120℃搅拌1 h脱水，再迅速加温至300℃聚集成颗粒。反应完成后，常温静置1 h；然后加入20 ml无水乙醇，20 000 r/min离心15 min；最后用无水乙醇冲洗3次，使用四氢呋喃溶解纳米颗粒，得到纳米颗粒的四氢呋喃溶液。利用透射电子显微镜对纳米颗粒的形状与粒径进行鉴定；永磁体实验定性对纳米颗粒的顺磁性进行验证。

1.2.2 CA-PLGA星型共聚物的合成和表征

CA-PLGA星型共聚物的合成方法如文献[2]所示。合成完成后利用核磁共振分析仪表征CA-PLGA的结构和检测材料的数均相对分子质量；使用凝胶渗透色谱检测CA-PLGA的相对分子质量，并通过保留时间计算分子质量的分布。

1.2.3 载Fe3O4纳米颗粒的制备

采用溶剂挥发法制备几种不同的纳米颗粒。具体步骤为：取100 μl质量浓度为100 mg/ml Fe3O4纳米颗粒的四氢呋喃溶液和100 mg PLGA，另取100 μl Fe3O4纳米颗粒溶液和100 mg CA-PLGA，溶于10 ml丙酮中；然后采用滴加的方法，慢慢加入200 ml体积分数为0.03%的聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）水溶液中，800 r/min搅拌过夜除去丙酮。悬液以2 000 r/min离心15 min，然后加入双蒸水洗3次除去未反应的药物和乳化剂，所得沉淀在10 ml的双蒸水中冷冻干燥。用同样方法可制得载0.1%香豆素-6的PLGA和载0.1%香豆素-6的CA-PLGA纳米颗粒。

1.2.4 纳米颗粒的表征

（一）粒径和Zeta电位

取1 mg纳米颗粒重悬于双蒸水中，使用超声分散悬液，之后利用纳米激光粒度仪检测纳米颗粒的粒径及粒度分布。另外，使用激光多普勒测速仪测定纳米颗粒的Zeta电位。

（二）内部形态、载药量和包封率

利用透射电子显微镜观察纳米颗粒的内部形态，利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）测定纳米颗粒的载药量和包封率。具体步骤：将纳米颗粒约5 mg溶解于1 ml丙酮中，搅拌均匀后转移到5 ml由双蒸水和乙腈（体积比为1∶1）组成的流动相中，通过通入氮气15 min挥发掉所有的丙酮直至溶液变得澄清；使用滤器过滤后，加入流动相定容到10 ml，进行HPLC分析。

1.2.5 细胞实验

（一）细胞培养

将HeLa细胞（104个/ml）接种于含DMEM培养基（已添加体积分数为10%的胎牛血清和质量浓度为10 g/L的抗生素）的培养皿中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

（二）细胞摄取实验

使用激光共聚焦扫描显微镜观察荧光纳米颗粒（载0.1%香豆素-6的PLGA纳米颗粒或载0.1%香豆素-6的CA-PLGA纳米颗粒）的细胞摄取情况。HeLa细胞培养24 h（密度大致为104个/孔）后，加入含荧光纳米颗粒（质量浓度为200 μg/ml）的培养基与细胞孵育过夜，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）洗3次；用多聚甲醛固定细胞20 min，PBS洗涤；再用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核染色30 min，PBS冲洗掉游离染料；最后用激光共聚焦显微镜观察并借助成像软件最终成像。

（三）细胞活力检测

MTT实验测定纳米Fe3O4颗粒、载Fe3O4的PLGA纳米颗粒以及载Fe3O4的CA-PLGA纳米颗粒对HeLa细胞的细胞毒性。将HeLa细胞传代至7.5 cm的培养皿中，加入10 ml DMEM培养基（含体积分数为10%的胎牛血清和质量浓度为10 g/L的抗生素），放入培养箱；当细胞贴壁长满后，用0.125%胰酶-EDTA溶液消化细胞并种于96孔板中；当96孔板中的细胞生长至70%左右，将培养基换成含纳米颗粒的培养基，控制Fe3O4纳米颗粒的质量浓度在25μg/ml，继续培养24 h；纳米药物要先经X射线灭菌，同时在培养板上设阳性对照，即只加入新鲜培养基；培养24h后，去除含纳米颗粒的培养基，用PBS洗涤3次；每孔加入90 μl培养基和10 μl MTT，继续培养3～4 h；最后除去所有溶液加入100 μl异丙醇，用酶标仪测定吸光度并进行定量分析。阳性对照细胞的存活率定为100%，未加入MTT的细胞可用于矫正吸光度。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米Fe3O4颗粒的表征

笔者使用永磁体对合成的纳米Fe3O4颗粒的顺磁性进行了验证，结果发现该颗粒的四氢呋喃溶液可被永磁体所吸引而发生液面的变化，且在撤去永磁体之后溶液液面又恢复原状，表明该溶液具有顺磁性；已知四氢呋喃是没有顺磁性的，所以表明了合成的纳米Fe3O4颗粒具有顺磁性。（图1）

图1 纳米Fe3O4颗粒的四氢呋喃溶液可被永磁体吸引

透射电子显微镜的结果表明，纳米Fe3O4颗粒主要呈立方体形状，倾向于聚集，且单个纳米颗粒粒径约7 nm。（图2）

图2 纳米Fe3O4颗粒的透射电镜图

2.2 CA-PLGA星型共聚物的表征

图3为CA-PLGA星型共聚物的1HNMR图谱，共有5个峰：1.62ppm处的a峰对应的是乳酸（lactic acid, LA）的重复单元—CHCH3中的伯氢原子；5.21 ppm处的b峰对应的是LA的重复单元—CHCH3中的叔氢原子；4.82 ppm处的c峰对应的是羟基乙酸（glycolic acid,GA）的重复单元—CH2—中的氢原子；两个d峰分别对应的是CA的重复单元—CH2—和—CH—中的氢原子，e峰则对应的是整体的CA-PLGA的羟基基团连接的氢原子—CHOH。核磁共振结果表明，已成功合成了CAPLGA星型共聚物。

图3 胆酸-聚乳酸-羟基乙酸共聚物的1H NMR谱

凝胶渗透色谱结果表明，CA-PLGA是共聚物，而不是简单的CA与PLGA的物理混合。综上所述，已成功合成了CA-PLGA，且CA-PLGA具有与PLGA不同的理化性质。

2.3 纳米粒的表征

2.3.1 粒径、Zeta电位和包封率的测定

表1显示了载Fe3O4的PLGA纳米颗粒、空载PLGA颗粒、载Fe3O4的CA-PLGA纳米颗粒及空载CA-PLGA颗粒的粒径、Zeta电位、包封率等特征参数，这些参数均会影响纳米颗粒的摄取及其在体内的半衰期等。

表1 载Fe3O4的PLGA和CA-PLGA纳米颗粒的特征参数

2.3.2 内部形态

载Fe3O4的PLGA和CA-PLGA纳米颗粒的透射电镜图如图4所示，载Fe3O4的PLGA纳米颗粒呈球状，内部核心呈六边形，粒径约200 nm；载Fe3O4的CA-PLGA纳米颗粒形态与PLGA纳米颗粒形态基本一致。

2.4 HeLa细胞对载香豆素-6纳米颗粒的摄取

HeLa细胞对荧光物质的摄取可用来评估纳米铁颗粒被癌细胞的摄取效果。根据表1中载香豆素-6的纳米颗粒粒径基本与载Fe3O4的纳米颗粒类似，笔者使用载香豆素-6的纳米颗粒来评估细胞对纳米颗粒的摄取能力。结果发现：载香豆素-6的PLGA和CA-PLGA纳米颗粒均能在细胞质中存在，表明这两种纳米颗粒均可被HeLa细胞所摄取；且CA-PLGA纳米颗粒的摄取效果明显好于PLGA纳米颗粒，证明CA能增加纳米颗粒与细胞的亲和力、促进纳米颗粒吸收的猜想是正确的。（图5）

图4 载Fe3O4的PLGA和CA-PLGA纳米颗粒的透射电子显微镜图

2.5 细胞毒性评价

细胞毒性结果见图6，相比于纳米Fe3O4颗粒本身，载Fe3O4的PLGA纳米颗粒作用下的细胞死亡率明显降低，而载Fe3O4的CA-PLGA纳米颗粒则可使细胞死亡率进一步降低。在Fe3O4质量浓度相同的情况下（25 μg/ml），24 h时的细胞存活率从80%升至87%，而48 h时的细胞存活率更是由64%升至76%；与纳米Fe3O4颗粒比较，载Fe3O4的PLGA和CA-PLGA纳米颗粒组的细胞存活率均有所升高（P＜0.05），且后者升高更显著。这些都证明了使用PLGA包裹纳米Fe3O4颗粒可有效降低其细胞毒性，而CA-PLGA包裹的纳米Fe3O4颗粒较单纯的PLGA纳米颗粒更能明显降低细胞毒性。

图63 种不同纳米Fe3O4颗粒对HeLa细胞的毒性作用曲线

3 讨论与结论

纳米Fe3O4颗粒有着非常广泛的应用，因此笔者希望能把纳米Fe3O4颗粒用于肿瘤细胞的观察和肿瘤细胞的杀伤。若能使用生物亲和力强的材料对纳米Fe3O4颗粒进行包裹，那么纳米Fe3O4颗粒就可直接进入细胞并能在体内保存一段时间而不被肝脏降解。另外，笔者还发现，若能将纳米Fe3O4颗粒引入靶向位点，则其就可较为准确地出现在肿瘤细胞附近，这样在使用MRI成像技术时，纳米Fe3O4颗粒就可成为很好的造影剂与增强剂，帮助医生更快、更精准地发现病灶所在。游劲松等[5]研究表明，根据磁热效应，在交变磁场的作用下具有顺磁性的物质会发生剧烈的振动从而产生高温。而何跃明等[6]提出，人体内的正常细胞与肿瘤细胞对于高温的耐受能力是不同的，肿瘤细胞在42℃环境下的半数致死时间远远短于同等条件下正常细胞的半数致死时间。因此笔者认为，在现有条件下，若能将纳米Fe3O4颗粒靶向作用于肿瘤细胞，则既能迅速通过MRI获得肿瘤细胞所在的位置，又能对其施用磁热效应仪从而将肿瘤细胞杀灭，达到诊疗一体化的目的。此外，在降低细胞毒性方面也可考虑使用壳聚糖[7]等其他材料，或许可使低毒性的纳米Fe3O4颗粒更有效地应用于诊疗一体化。

本研究成功制备了纳米Fe3O4颗粒以及载Fe3O4的PLGA和CA-PLGA纳米颗粒。其中，载Fe3O4的PLGA和CA-PLGA纳米颗粒均呈球状，粒径约为200 nm，理论载药量为10%，且当Fe3O4纳米颗粒的质量浓度相同（25 μg/ml）时，载Fe3O4的CA-PLGA纳米颗粒的细胞毒性低于对应的PLGA纳米颗粒。因此，相比于PLGA纳米颗粒，肿瘤细胞对CA-PLGA纳米颗粒的摄取能力更强，并在接下来的MRI中可以起到更好的作用。

利益冲突无

（图5见插页3-6）

[1]胡鸿飞,李大成,吉红兵.纳米氧化铁的制备方法及进展[J]．四川有色金属,2001,7(1)：15-20.DOI：10.3969/j.issn.1006-4079.2001. 01.004. Hu HF,Li DC,Ji HB.Development and method of nano-meter iron oxide particles[J].Sichuan Nonferrous Metals,2001,7(1)：15-20. DOI：10.3969/j.issn.1006-4079.2001.01.004.

[2]ZengX,TaoW,MeiL,etal.Cholicacid-functionalized nanoparticles of star-shaped PLGA-vitamin E TPGS copolymer for docetaxel delivery to cervical cancer[J].Biomaterials,2013,34(25)：6058-6067.DOI：10.1016/j.biomaterials.2013.04.052.

[3]张超,马桂蕾.纳米粒摄取机制的研究进展[J].国际生物医学工程杂志,2015,38(1)：57-62.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015. 01.014. Zhang C,Ma GL.Research progress on the cellular uptake mechanism of nanoparticles[J].Int J Biomed Eng,2015,38(1)：57-62.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.014.

[4]Maity D,Choo SG,Yi JB,et al.Synthesis of magnetite nanoparticles via a solvent-free thermal decomposition route[J].J Magn Magn Mater, 2009,321(9)：1256-1259.DOI：10.1016/j.jmmm.2008.11.013.

[5]游劲松,杨丽,肖萍,等.热疗用四氧化三铁磁性纳米粒子的制备及其性质表征[J].中国药剂学杂志,2008,6(6)：309-315. You JS,Yang L,Xiao P,et al.Preparation and characterization of Fe3O4magnetic nanoparticles for hyperthermia[J].Chin J Pharm, 2008,6(6)：309-315.

[6]何跃明,吕新生,艾中立,等.恶性肿瘤的磁靶向热疗[J].国外医学：物理医学与康复学分册,2003,23(2)：96-100.DOI：10.3870/j. issn.1001-117X.2003.02.015. He YM,Lyu XS,Ai ZL,et al.Magnetic-targeted thermochemotherapy for malignant tumors[J].Foreign Med Sci：Phys Med Rehab,2003, 23(2)：96-100.DOI：10.3870/j.issn.1001-117X.2003.02.015.

[7]董霞,刘兰霞,朱敦皖,等.低分子质量壳聚糖修饰多壁碳纳米管的制备及细胞毒性研究[J].国际生物医学工程杂志,2015, 38(1)：11-14.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.003. Dong X,Liu LX,Zhu DW,et al.Preparation and cytotoxicity study of multi-wailed carbon nanotubes modified with low-molecularweight chitosan[J].Int J Biomed Eng,2015,38(1)：11-14.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2015.01.003.

Effects of magnetic iron oxide-loaded CA-PLGA nanoparticles on HeLa cells

Zhang Hongqiu,Zeng Xiaowei, Mei Lin
School of Life Sciences,Tsinghua University,Beijing 100084,China(Zhang HQ);Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University,Shenzhen 518055,China(Zhang HQ,Zeng XW,Mei L)

ObjectiveTo investigate the effects of magnetic iron-oxide(Fe3O4)nanoparticles with different skin materials on cytotoxicity against human cervix cancer HeLa cells.MethodsThe Fe3O4nanoparticles were prepared by solvent-free dissolving method and then covered with poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)and cholic acid (CA)-PLGA respectively.After the characterization,the uptake of nanoparticles by HeLa cells was observed by laser scanning confocal microscopy,and thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)assay was used to assess the cytotoxcity of the Fe3O4-loaded nanoparticles against HeLa cells.ResultsThe size of single Fe3O4nanoparticle was about 7 nm. The Fe3O4-loaded PLGA and CA-PLGA nanoparticles were spherical in shape under transmission electron microscope,around 200 nm in diameter,and the theoretical drug-loading capacity was 10%.At the same Fe3O4nanoparticles concentration of 25 μg/ml,the Fe3O4-loaded CA-PLGA nanoparticles showed less toxicity than Fe3O4-loaded PLGA nanoparticles.ConclusionsStar-shaped copolymer CA-PLGA is promising in decreasing cytotoxicity of magnetic Fe3O4nanoparticles and expanding its application in living organisms.

Star-shaped copolymer;Iron Oxide;Nanoparticles;Cytotoxicity

梅林，Email：mei.lin@sz.tsinghua.edu.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．03．008

国家自然科学基金面上项目（31270019）；广东省杰出青年科学基金（2014A030306036）；广东省科技计划公益研究与能力建设专项（2016A020217001）；深圳市科技计划基础研究项目（JCYJ20150430163009479,JCYJ20150529164918738）Corresponding author:Mei Lin,Email:mei.lin@sz.tsinghua.edu.cn

2016-03-11）