腈水合酶发酵过程的染菌途径与分析

庄贤军，吴丛伟

（浙江鑫甬生物化工股份有限公司，浙江宁波 315204）

腈水合酶发酵过程的染菌途径与分析

庄贤军，吴丛伟

（浙江鑫甬生物化工股份有限公司，浙江宁波 315204）

为了找出染菌原因，采取有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小，结合多年发酵和丙烯酰胺行业的工作经验，对微生物法生产丙烯酰胺行业的染菌类型和原因进行粗略分析。

发酵；染菌；原因分析

引言

工业发酵需确保纯种发酵，所谓染菌，是指在纯种发酵培养基中侵入其他微生物。引起染菌的环节很多，在目前的科学技术条件下，还无法做到不染菌，发酵染菌的防治一直是发酵工厂的重要课题［1］，微生物法生产丙烯酰胺行业同样无法回避这个课题。发酵工厂对染菌的对策是防重于治，在设备管道安装上尽量避免死角，同时建立健全、规范的技术操作规程，把工作做在前面，防患于未然，做到尽量防止染菌发生。而一旦发生染菌，则要尽可能找出染菌原因，采取有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小［1，2］，消除各种隐患，降低染菌率，对微生物法生产丙烯酰胺行业的染菌类型和原因进行细致分析。

1 染菌分析

腈水合酶发酵中，一般通过镜检或平板跟踪判断是否染菌，发生染菌后，一般从以下三个方面来分析原因。

1.1 从染菌时间（2天）看

腈水合酶发酵罐一般18小时取第一个样，以后每隔6小时取样，镜检发现染菌：如早期染菌，18小时镜检发现染菌，一般有三个方面：种子带菌、培养基灭菌不彻底、设备问题。如中后期染菌，方向有 ：设备或阀门漏、操作不当、空气、补料等［1，2］。

1.2 从染菌类型（芽孢杆菌、无芽孢杆、格兰氏阴性菌、霉菌）分析

芽孢杆菌：来源基本为培养基灭菌不彻底、设备存在死角［1，2］。无芽孢杆菌或球菌：来源一般是蒸汽冷凝水或空气。格兰氏阴性菌或球菌：来源一般是水或设备渗漏。霉菌：霉菌一般比较少，来源灭菌不彻底、操作不严。

1.3 大批发酵罐染菌和个别发酵罐染菌

大批发酵罐染菌，且染菌是同一种菌，一般来源是空气或种子带菌［1，2］。个别罐连续染菌基本由设备造成，如阀门渗漏、罐体渗漏、死角等，而造成个别罐偶然染菌的因素较多，要注意操作和设备细节。

2 防治染菌途径

腈水合酶发酵发生染菌时，要根据染菌时间、染菌类型、染菌范围，进一步分析产生染菌的途径，找出染菌的原因，并达到防治染菌的目的。

2.1 影响灭菌效果的因素

（1）培养基成分：有机物质能在细菌周围形成保护膜，使灭菌效果下降，腈水合酶发酵原料中，主要是酵母膏。（2）培养基状态：液态物质消毒效果好于固态。（3）培养基中有大颗粒和结块物料要注意，特别是酵母膏，需要溶解后加入，否则容易出现染菌可能。（4）物料中微生物数量：夏季设备和原料中微生物数量增加，容易造成灭菌不透，需要适当延长灭菌时间。（5）空气排除情况：消毒过程需要充分排气，如果空气没有排净，会造成假压，造成消毒不透［1，2］。（6）搅拌翻动对灭菌影响：消毒过程要求培养基翻动良好，否则影响灭菌效果。（7）泡沫影响消毒效果：如果培养基消毒过程起泡严重，泡沫传热效果差，泡沫中细菌不易杀死，一旦泡沫多，需增加消泡剂用量。（8）培养基pH值影响灭菌效果：培养基pH偏酸性或偏碱性，比中性培养基消毒效果更好。

2.2 消毒操作要求

（1）要求消毒蒸汽压力平稳、三路进蒸汽要求平稳，进汽和排气不能忽大忽小，其中阻力大的空气分布管进汽阀门应先开，并适当开大一点，阻力小的阀门后开，以确保各路进汽口有足够蒸汽，培养基能激烈翻动和混合，灭菌彻底。（2）发酵罐或种子罐直接连接的管道和阀门，必须遵守“不进则出”原则，杜绝有的阀门似开非开，处于既不进蒸汽也不排气的状态［1，2］。（3）避免罐内有积垢造成死角，洗罐必须彻底，不但每次要清洗干净，而且要定期拆卸内部构件，彻底清理死角。（4）各路进蒸汽要畅通，如果有进汽阀门开得过小，或阀门阀芯脱落，造成事实没有进汽或进汽太小，阀门处于“假开”状态，容易造成死角，导致灭菌不彻底。（5）夹套加热时，就要适当打开排气阀门，确保罐内空气排充分，避免假压。（6）发酵罐体积大，升温时间延长，实消保压时间比小罐可以适当缩短，否则容易出现培养基消毒过头，营养成分破坏严重。而罐子小，升温快，升温时间短，则要适当延长保压时间，否则容易消毒不透。（7）温度表和压力表需要定期校验，以免因温度和压力不准，造成消毒不透。

2.3 关于死角

所谓死角，就是消毒时，因为某些原因使灭菌温度达不到，或不易达到的局部区域。腈水合酶发酵罐内的死角范围大概有以下几个方面：（1）环形空气分布管死角，环形空气分布管内部容易积垢，造成死角［1］。（2）罐体制作造成的死角，制作过程不注意细节，局部出现死角，容易染菌。（3）管道、管件和阀门安装存在死角。（4）法兰焊接死角、垫片安装死角、以及焊接和安装不注意产生的死角也会引起染菌。（5）罐底、罐内不易清洗部位、以及隐蔽部位污垢积聚形成死角，除每罐需要需要仔细清洗外，还需定期拆检内部构件，彻底清理死角。（6）焊接部位，挡板，轴、搅拌叶、内盘管及盘管支架等易结垢部位，需清洗要彻底，并定期入罐除垢。（7）内部结构和管路安装方式不合理产生死角，必须尽量避免。（8）不容易溶解或打散的物料，特别是酵母膏，须单独溶解后投入罐内，否则难溶解的原料沉淀在罐底，溶解慢，会形成死角，消毒不透。（9）移种管道必须蒸汽畅通，避免存在死角。（10）排污管、排气管、移种管、出料管等须单独安装，不能几个罐并联，否则容易出现交叉污染。

2.4 种子带菌

腈水合酶发酵中，种子带菌引起的染菌几率不太高，但它是发酵前期染菌重要原因之一［1］，造成种子带菌从以下几个方面查找原因：

2.4.1 种子培养基灭菌不彻底

丙烯酰胺工厂的腈水合酶菌种室碰到过几种情况：a.灭菌锅排气管坏，造成排气不充分，空气没排完造成假压，消毒不透。b.消毒培养基瓶子放得太紧密，或挡住蒸汽通道，影响灭菌效果。c.试管斜面等器材放入大烧杯内，然后放入灭菌锅灭菌，烧杯内空气无法从底部排走，试管内的培养基灭菌不透，造成斜面染菌。d.消毒结束后，放气过程太快，造成三角烧瓶内的物料溅湿纱布，湿纱布的空气过滤效果差，培养过程造成染菌。

2.4.2 无菌室和超净工作台

a.要求无菌室密封性良好，否则外界空气漏入，无法保证无菌环境，会产生污染。b.无菌室每天操作前后必须用紫外灯灭菌，紫外线杀菌力最强的波长是2560-2260A，紫外灯管老化后，要及时更换，否则灭菌效果降低后，无法保证紫外线灭菌效果［5］。c.无菌室的四壁、地面、天花板、空间需要定期用化学灭菌剂灭菌，灭菌剂应交替使用。d.每次使用无菌室时间不能过长，操作过程要遵守无菌室管理规范，尽量少走动，少说话，无菌室每次使用后要做好清洁，用过器具要经灭菌处理［1］。e.超净工作台操作区每次使用前后要紫外线灭菌，使用前后操作台用75 %脱脂酒精棉球或消毒液消毒。f. 超净工作台工作原理是利用无菌空气层流技术，空气流速一般为0.05 m/s［1］，无菌操作期间，操作台上不能堆放太多物品，以免影响层流空气的过滤效果。g.超净工作台的过滤网要定期及时更换，否则一旦过滤失效，超净工作台的无菌条件无法保证。

2.4.3 无菌操作

无菌操作台上各项接种操作使用酒精灯，在靠近火焰旁操作，接种过程要遵守无菌操作规范。

2.4.4 摇瓶染菌

生产丙烯酰胺的腈水合酶，一级摇瓶在摇床上培养，摇床转速可调节，一般控制170r/min左右，如果转速太快，或摇床长时间运转后出现不平稳跳动，则摇瓶内种子液会溅湿摇瓶口的纱布［1］，纱布的过滤效果失效，容易出现染菌。

2.5 空气系统染菌

腈水合酶发酵生产使用的空气，须经空气预处理系统进行两次冷却、两次油水分离，经空气加热器加热后，再经空气总过滤器、预过滤器、精过滤器三级过滤后，进入种子罐和发酵罐，每个罐配一套预过滤器、精过滤器和蒸汽过滤器。

（1）空气预过滤系统的两次冷却器、两次油水分离器、空气贮罐，规定每2小时定时排油水。（2）空气进总过滤器前，须经空气加热器加热，加热温度控制60℃，相对湿度控制在60%以下。（3）总过滤器直径DN800，棉花要加工成DN1000的棉饼，逐层、均匀、平整装入总过滤器，避免棉饼翻身，引起空气走短路。棉饼装量既不能太松，也不能太紧，太松容易翻身，无法达到过滤效果，太紧容易造成总过滤器灭菌不彻底，且过滤器前后空气压差大。总过滤器采用∮200×500四支滤芯。（4）预过滤器采用JPFYUD型预过滤器，精过滤器采用JPF型精过滤器［3］，蒸汽采用JLS-F蒸汽过滤器。（5）JPF-YUD型预过滤器一般无需消毒，过滤精度0.3μm，装入滤芯后可直接使用，其滤芯中心柱是耐热聚丙烯。JPF型精过滤器需先消毒再使用，过滤精度0.1μm，其滤芯中心柱是304不锈钢。（6）总过滤器和精过滤器消毒前，先要排出蒸汽管道的冷凝水，否则会造成棉花和滤芯受潮，影响灭菌效果和空气过滤效果。（7）总过滤器灭菌时，控制在灭菌蒸汽压力0.1～0.12MPa，每次60min，并确保上下排气畅通，如蒸汽不畅通，蒸汽无法穿透棉花，容易灭菌不彻底，但灭菌温度和蒸汽压力太高，又容易造成滤芯橡皮圈变形，不能密封，滤芯失效。（8）精过滤器消毒控制在0.1～0.12MPa，每次30min，滤芯灭菌寿命160次，温度升高，寿命降低，温度太高甚至会造成滤芯熔化。精过滤器不需每批次灭菌，一般没有染菌可以半个月灭菌一次，染菌时，则每次要灭菌。（9）如有发酵罐连续染菌［4］两罐以上，须拆检精过滤器滤芯是否完好。

2.6 设备和管件渗漏引起染菌

发酵行业的渗漏一般都是极其微小的，往往无法直接通过肉眼观察，而要通过一定的试漏和查漏方法才能找到漏点，腈水合酶发酵也一样。（1）罐体渗漏：罐体最容易渗漏部位是液层以下焊缝和罐底靠近空气入口处，有夹套的需通过夹套蒸汽烘干后试漏，无夹套的直接空气试漏，查到漏点后补焊。（2）冷却盘管渗漏：盘管最容易渗透部位是焊缝和弯头处，需清除盘管外壁后，将盘管烘干，管内加压试漏，发现漏点后补焊。（3）管件渗漏：管件渗漏最常见的部位是直接和罐内连接的阀门和近罐法兰垫片漏，要求勤拆检阀门、及时更换损坏变形的阀芯，防止阀芯老化渗漏。（4）轴机械密封漏：一般有两种情况，一种是机封动环和静环的密封面漏，另一种是静环底部O型密封圈老化渗漏，这两种情况渗漏都会造成灭菌时漏蒸汽，并造成蒸汽冷凝水积聚，在罐压波动时，漏入发酵罐造成染菌，特别是O型密封圈渗漏，危险性更大，必须及时更换。

2.7 操作不当引起染菌

操作不当主要有几个方面：（1）洗罐、拆检阀门等工作做得不够仔细。（2）消毒过程操作不当。（3）操作不当造成罐压跌零甚至造成负压。（4）保压操作不当，造成罐内料液倒回到过滤器，过滤器失效。

3 染菌后的挽救

腈水合酶生产过程染菌以后要根据具体情况，及时采取措施加以挽救：（1）种子罐染菌，不管染菌时间迟早和染菌种类，都必须消毒灭菌降温后，倒罐。（2）发酵早期染菌，可适当补加培养基成分后，重消后再接种和发酵。（3）如果是发酵中后期染菌，如果染的是球菌或细杆菌，一般不影响产酶，可以共生共长，继续发酵到结束。（4）如果中后期染粗杆菌或芽孢，则要加大通风量、抑制杂菌，在酶活达到使用要求后，及时提前放罐，否则往往容易出现发酵液分层倒罐［1，2］。（5）出现染菌后，下一罐投料必须更加重视，特别是芽孢杆菌，要预防出现连续染菌：染菌罐必须重视拆检阀门；染菌罐的精过滤器必须重新消毒；染菌罐洗罐必须更加仔细，入罐检查消除罐内死角，必要时甚至要拆除罐内附件，清除积垢后再装好使用；空消时加入甲醛熏蒸，甲醛加量约0.15 L/m3，并适当延长空消时间［1］。（6）加强车间和环境的清洁卫生，定期对环境进行消毒，杜绝杂菌的生长和繁殖机会。

4 总结

和所有其他发酵行业一样，腈水合酶发酵生产中。尽管造成染菌的原因极其复杂，生产环节众多、影响因素错综复杂，各工厂生产设备和生产环境又各不相同，但是实践证明，染菌是完全可以控制的。只要我们思想重视，工作和操作认真、仔细、负责，加强管理，建立必要的规章制度和操作规程，要树立防重于治的思想，操作严格、工艺和设备合理，重视各个工作环节，避免产生染菌的隐患，是能够防止或减少染菌的。一旦出现染菌，就要仔细分析造成染菌的原因，采取有效的措施，排除和消除各个环节中存在的问题，可以尽快克服和解决染菌，减少损失，同时降低生产染菌率，确保生产正常进行。

[1].邬显章.《酶的工业生产技术》, [M].吉林：吉林科学技术出版社，1988：258-285.

[2].天津轻工学院等.《氨基酸工艺学》, [M].北京：中国轻工业出版社，1991：151-162.

[3].T Suami，S Ogawa，N Chida. The revised structure of validamycin A [J]. Journal of Antibiotics,1980,33(1):98-99.

[4]. Wang Z M , Liang X T , Chen S F .gnetifolin A [J] .Chinese Chemical Letters,1995,6(8):683-686.

［5］.钱存柔等.《微生物学实验》, [M].北京：北京大学出版社,1985：192-204.

The Route and Analysis of Microbiological Contaninationin the Fermentation of Nitrile Hydratase

Zhuang xianjun,Wu congwei
(Zhejiang xin yong biological chemical co., ltd,Zhejiang Ningbo,315204)

In order to find out the infection causes, take effective measures, to reduce fermentation bacteria contamination caused by the loss to a minimum, with many years of ferment and acrylamide industry work experience, the microbial production of acrylamide in industry contamination types and reasons were roughly analyzed.

Fermentation; Contanination; Cause analysis

TQ223

A

2096-0387（2016）04-0062-03

庄贤军（1968-），男，浙江宁波人，工程师，工学学士，研究方向：微生物丙烯酰胺的工业化生产和研究。