德国小蠊核糖体相关膜蛋白的克隆和表达

赵文静，张晶，修江帆

（贵州医科大学基础医学院，贵州贵阳550025）

德国小蠊核糖体相关膜蛋白的克隆和表达

赵文静，张晶，修江帆

（贵州医科大学基础医学院，贵州贵阳550025）

通过同源克隆获得德国小蠊RAM P的cDN A，并成功进行原核表达，使用生物信息学方法对其进行鉴定和分析。结果表明，德国小蠊RAM P的cDN A全长195bp，编码64个氨基酸，与诸多昆虫的RAM P具有较高的同源性，是碱性的小分子膜整合蛋白，单次跨膜，亲水性较高。该研究能够为德国小蠊RAM P的功能研究提供有价值的基础材料。

德国小蠊；核糖体相关膜蛋白；克隆；原核表达

德国小蠊（Blattellagermanica）是蜚蠊目昆虫中分布最为广泛的种类，与人类生活密切相关。其适应能力强，繁殖快，并具有迁徙、扩散的习性，已成为全球最普遍、最难治理的城市卫生害虫［1］。

核糖体相关膜蛋白（Ribosome-associated Membr ane Protein，RAMP），又称压力相关内质网蛋白（Stressassociated Endoplasmic Reticulum Protein，SERP），是一类与应激相关的蛋白。Yamaguchi等［2］使用缺氧大鼠模型，获得大鼠RAMP的cDNA，并验证在缺氧条件下，大鼠通过过表达RAMP以抑制其他膜蛋白的合成。而当环境压力（缺氧）解除后，该蛋白能够促进新合成蛋白的谷氨酸化。现今，多种昆虫RAMP的cDNA和EST已经获得并上传至NCBI，但与昆虫相关的研究文献较少，仅查阅到2005年Yao等［3］克隆并鉴定家蚕的RAMP蛋白。鉴于此，该研究克隆并表达德国小蠊RAMP蛋白，使用分子生物学方法对其进行鉴定和分析，为进一步研究该蛋白的功能奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料

德国小蠊敏感系引种于中国科学院昆明动物研究所，繁殖并饲养于贵州医科大学生物学教研室蜚蠊目养殖室。饲养温度28℃，相对湿度65%，自然光照。取成虫作为试验材料。

1.2 RAMP基因的克隆及测序

按照TAKARA公司RNAiso PLUS说明书提取总RNA，经电泳检测及GeneQuant公司核酸定量分析仪测定，选取A260/A280的比值范围为1.95～2.00的样本，以1μg总RNA为模板，按照cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA第一链。

根据美洲大蠊RAMP的EST序列（NCBI登录号：FG130770），设计同源克隆的引物。引物设计软件为Primer Primer5.0［4］，引物为：上游5‘-ATGGCACCAAAACAAAGAATGCG-3’，下游5‘-TTAGGCTGCTCTGATGCTCTGG-3’。使用该引物对上述cDNA进行PCR扩增，扩增产物连接至载体pMD18-T，送上海生工生物公司测序鉴定。

1.3 RAMP蛋白的原核表达及鉴定

以克隆基因pMD18T-RAMP质粒为模板，进行PCR扩增，回收PCR产物，纯化定量。将纯化产物与pEASY-E1载体25℃连接10min，转化至感受态大肠杆菌Trans1-T1，次日挑取阳性克隆，放入含苄青霉素（50mg/mL）的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒选用载体T7启动子上游引物、T7终止于下游引物及目的基因上游、下游引物进行PCR及测序鉴定。将阳性质粒转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，次日挑取阳性克隆，进行PCR鉴定。

取过夜培养的菌液60μL，加入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，250r/min震摇约5h至OD600=0.6，加入IPTG诱导表达，取过夜诱导表达的pEASY-RAMP菌液，SDS-PAGE电泳检测。

1.4 RAMP基因的生物信息学分析

使用Pfam［5］确认蛋白的基因家族。使用ORF Finder［6］预测cDNA的开放阅读框。使用Protparam［7］分析蛋白的分子量、理论等电点和亲水性。使用TMHMM［8］预测蛋白的跨膜结构。

2 结果与分析

2.1 德国小蠊RMAP全长cDNA

以德国小蠊成虫cDNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。其中，第一泳道标示连接着上下游特异引物的目的产物，约200bp；第三四泳道标示的PCR产物结果与第二泳道接近，说明重组质粒连接方向正确。测序结果显示，德国小蠊RAMP的cDNA全长195bp，测序结果与电泳结果一致。序列上传至NCBI，登录号为KT820541。

图1 cDNA模板及pEASY-RMAP重组质粒

2.2 德国小蠊重组质粒的原核表达

SDS-PAGE电泳（见图2）显示，在约10kD处有外源蛋白表达条带出现，除去pEASY载体HIS标签及部分载体蛋白（大小约3.2kD），电泳产物与目标蛋白的理论分子量6.97kD基本一致。而未经诱导的菌株在此位置无显著条带，说明目的蛋白表达成功。

图2 RAMP重组蛋白的诱导表达

2.3 德国小蠊RAMP的生物信息学分析

ORF Finder预测德国小蠊RAMP的cDNA编码64个氨基酸（见图3）。经Blastp比对发现，德国小蠊RAMP与美洲大蠊、台湾家白蚁、柑橘木虱、欧洲熊蜂等多种昆虫的RAMP序列相似度超过80%，与一些鱼类的序列相似度也高达70%左右，这说明RAMP蛋白是一类高度保守的蛋白，推测由管家基因编码。

图3 德国小蠊RAM的cDNA及编码氨基酸

Pfam检测该蛋白属于核糖体相关膜蛋白4超家族（RAMP4，PF06624）。使用该序列与多种昆虫的RAMP作为种子序列在德国小蠊的基因组上进行tBlastn检索，仅发现一段核酸序列（JPZV01234229.1）与之对应，由此推测该基因是单拷贝基因，其基因家族在德国小蠊基因组中只有一个成员。

Protparam预测蛋白理论分子量为6.99kD，等电点pI为10.38，亲水性平均系数GRAVY为-0.058。TMHMM预测该蛋白包含一个跨膜结构域：36～58aa处（见图4）。这些结果表明德国小蠊RAMP是碱性的小分子膜整合蛋白，单次跨膜，且亲水性较高。

图4 德国小蠊RAMP蛋白的跨膜结构域

3 结论

该研究通过同源克隆获得德国小蠊RAMP的全长cDNA，并成功对其进行原核表达。此外，使用生物信息学方法分析了该基因及其编码蛋白的理化特性等，为进一步研究德国小蠊RAMP的功能奠定了基础。

[1]霍京.德国小蠊(Blattellagermanica)的种群特性及控制策略研究[D].济南:山东师范大学,2012.

[2]Y amaguchi A, Hori O, Stern D M, et al. Stress-associated endoplasmic reticulum protein 1 (SERP1)/Ribosome-associated membrane protein 4 (RAMP4) stabilizes membrane proteins during stress and facilitates subsequent glycosylation[J].Journal of Cell Biology,1999,147(6):1195-204.

[3]Yao Q, Hu Z, Xu J, et al. Cloning and Characterization of Ribosomeassociated Membrane Protein 4 (RAMP4) gene in silkworm Bombyxmori[J].Research,2005,10(2):125-129.

[4]Lalitha S. Primer Premier 5[J]. Biotech Software & Internet Report,2000.

[5]Finn R D, Coggill P, Eberhardt R Y, et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future[J].Nucleic Acids Research,2015,44(Database issue):D279-D285.

[6]Hancock J M, Bishop M J. ORF Finder (Open Reading Frame Finder)[M]. Dictionary of Bioinformatics and Computational Biology.U.S.A.:John Wiley & Sons, Inc. 2004.

[7]Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, et al. In The Proteomics Protocols Handbook[M]. The Proteomics Protocols Handbook.Totowa, NJ:Humana Press, 2005:571-607.

[8]Möller S, Croning M D R, Apweiler R. Evaluation of methods for the prediction of membrane spanning regions[J].Bioinformatics, 2001,17(7):646-53.

Cloning and Expression of Ribosome Associated Membrane Protein of Blattellagermanica

Zhao Wen-jing, Zhang Jing, Xiu Jiang-fan
(School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guizhou Guiyang 550025)

cDNA of BlattellagermanicaRAMP was obtained by Homologous cloning, successfully carried out the prokaryotic expression,and identified and analyzed it by using biological information method. The results showed that the ramp of BlattellagermanicacDNAwas 195bp, code 64 amino acids, RAMP had high homology with many insects, it was a basic small molecular membrane integrated protein, with a single transmembrane and high hydrophilicityThis study could provide material basis for the valuable function of RAMP of Blattellagermanica.

Blattellagermanica; Ribosome associated membrane protein; Cloning; Prokaryotic expression

S718.45

A

2096-0387（2016）04-0056-03

赵文静（1982-），女，贵州铜仁人，硕士，讲师，研究方向：昆虫分子生物学。

修江帆（1984-），男，博士，副教授，研究方向：昆虫资源利用。