芳姜黄酮对照品制备

石 洋， 潘博文， 王慧娟， 刘雄伟， 曹 煜， 刘雄利， 周 英*

（1.贵州大学药学院，贵州省中药民族药创制工程中心，贵州贵阳550025；2.贵阳医学院附属医院皮肤科，贵州贵阳550025）



芳姜黄酮对照品制备

石 洋1， 潘博文1， 王慧娟1， 刘雄伟1， 曹 煜2， 刘雄利1， 周 英1*

（1.贵州大学药学院，贵州省中药民族药创制工程中心，贵州贵阳550025；2.贵阳医学院附属医院皮肤科，贵州贵阳550025）

摘要:目的 以姜黄挥发油为原料，建立高纯度芳姜黄酮对照品的制备方法。方法 硅胶柱层析和制备型HPLC法对姜黄挥发油进行分离纯化，EI-MS、1H-NMR和13C-NMR等手段确认对照品结构，TLC和HPLC法检测对照品纯度，温度、湿度和光照试验考察对照品稳定性，HPLC法研究芳姜黄酮含有量测定的色谱条件。结果 所得芳姜黄酮的纯度大于99％，其外观性状无变化，含有量稳定。另外经考察，确定色谱条件为Hedera C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；检测波长242 nm；流动相甲醇-水（80∶20）；进样量10 μL；柱温25℃；体积流量0.8 mL/min。结论 该方法制得的芳姜黄酮对照品符合中药化学对照品相关要求，可用于姜黄药材及其制剂的质量控制。

关键词:姜黄挥发油；芳姜黄酮；对照品；制备工艺

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.054

姜黄为姜科姜黄属植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎［1］，始载于《唐本草》［2］，其根茎入药，具有破血行气，通经止痛功效。现代医学研究表明，姜黄具有抗炎、抗氧化、抗菌及抗肿瘤作用。姜黄属植物主要包含姜黄挥发油和姜黄素两大类成分［3-8］，其中姜黄挥发油中含有芳姜黄酮、姜烯等化合物［9-12］，不仅有抗肿瘤、抗癌、抗菌和止咳平喘的作用，而且还能增强免疫功能［13-15］。

在现有的制剂（如“姜黄消痤搽剂”）企业质量标准中，含有量测定项主要是针对姜黄素和芦丁两种成分，但芦丁为“姜黄消痤搽剂”的非专属性成分，另外仅以姜黄素为含有量测定指标时，难以全面反映该复方制剂的质量。由于芳姜黄酮在“姜黄消痤搽剂”中的含有量相对较高，并且为专属性的活性成分，因此在测定项中新增芳姜黄酮的含有量测定，将能以多监控指标的评价方式来实现“姜黄消痤搽剂”的质量控制。

本实验研究了从姜黄挥发油中分离和纯化芳姜黄酮的方法，现已成功制备出芳姜黄酮对照品，可为其制备提供借鉴和参考。

1 材料与仪器

1.1 材料 姜黄挥发油（贵阳舒美达制药厂有限公司）；柱色谱、薄层色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；乙腈、甲醇为色谱纯（德国Merck公司）；其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器 Agi1ent1260分析型、制备型HPLC色谱仪，包括四元及二元泵、自动及手动进样器、柱温箱、DAD及可变紫外检测器、ChemStation色谱工作站（美国Agi1ent Techno1ogies公司）；FA2004型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；RE-2000A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ZF-20D型三用紫外分析仪（上海予正仪器设备有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海博迅实业有限公司）；Bruker-400核磁共振仪，TMS为内标（德国Bruker公司）；HP-5973质谱仪（美国惠普公司）。

2 方法与结果

2.1 芳姜黄酮的分离纯化

2.1.1 硅胶柱层析分离 取姜黄挥发油10 g，用石油醚溶解，置于瓷蒸发皿中，以12 g硅胶拌样，挥干溶剂后湿法上柱，石油醚-乙酸乙酯（15∶1）开始洗脱，TLC展开剂为石油醚-乙酸乙酯（15∶1），254 nm下观察。根据TLC显示结果，收集Rf=0.7处的混合物，得到组分1 7.3 g，继续以石油醚-乙酸乙酯（50∶1）洗脱，收集Rf=0.5处的混合物，得到组分2 5.2 g。然后，HPLC法对组分2进行定性分析，色谱柱为Hedera C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（90∶10）；柱温25℃；检测波长254 nm；进样量15 μL，结果见图1。

注:图中的3个峰从左至右，分别定为组分1、组分2和组分3图1　姜黄挥发油的HP L C图谱

2.1.2 制备型HPLC色谱分离 应用制备型HPLC色谱柱对Fr.2进行分离，色谱柱为Agi1ent ZORBAX SB-C18（21.2 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-水（80∶20）；体积流量10 mL/min；检测波长254 nm；进样量0.4 mL。结果，共收集得到3个组分，浓缩蒸干，即得组分1、组分2和组分3，然后对其进行EI-MS、1H-NMR、13C-NMR测定。

2.1.3 结构确认 通过EI-MS、1H-NMR、13C-NMR测定，确定组分1为芳姜黄酮。其中，EI-MS m/z: 216（M+，6），201（M+-Me，7），132（11），119（44），91（25），83 （100），77（14），55（70），与谱库中芳姜黄酮数据的匹配率为98％。1H-NMR（CDC13，400 MHz）δ: 1.17（3H，d，J=7.2 Hz），1.78（3H，d，J=1.2 Hz），2.03（3H，d，J= 0.8 Hz），2.23（3H，s），2.50-2.56（1H，m），2.61-2.66 （1H，m），3.19-3.24（1H，m），5.95（1H，dd，J=1.2，0.8 Hz），7.03（4H，d，J=1.2 Hz）。13C-NMR（CDC13，100 MHz）δ: 20.7，21.0，22.0，27.7，35.3，52.7，124.1，126.7，129.1，135.6，143.7，155.1，199.9。

2.2 芳姜黄酮的纯度检测

2.2.1 薄层色谱法 取芳姜黄酮适量，加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg化合物的溶液，作为供试品。然后，分别吸取2、5、10、15、20 μL，点于硅胶GF254薄层板上，采用上行展开方式，依次以石油醚-乙酸乙酯（15∶1）、正己烷-丙酮（25∶1）、正己烷-氯仿（5∶1）为展开剂，254 nm下观察，碘蒸气显色。结果，经3个展开系统、2种显色方式检测时，TLC上均呈现单一斑点，而且未见杂质。

2.2.2 HPLC色谱法 采用分析型Agi1ent1260型HPLC色谱仪，色谱柱为Hedera C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；柱温25℃；流动相甲醇-水（80∶20）；进样量10 μL；体积流量1.0 mL/min；分别设定204、220、254、280、310 nm 5个信号通道检视，用于考察芳姜黄酮的纯度。

取芳姜黄酮适量，加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg化合物的溶液，作为供试品，然后取空白溶剂（甲醇）和供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件测定。结果，扣除溶剂干扰峰后，芳姜黄酮的色谱峰面积归一化含有量在各波长均大于99％，见表1。

表1　芳姜黄酮在各波长下归一化含有量的测定结果

2.3 芳姜黄酮稳定性考察 按照《中国药典》2010年版二部附录XIXC“原料药与药物制剂稳定性试验指导原则”，对芳姜黄酮进行室温、高湿、强光照射影响因素试验。然后，按“2.2.2”项下方法检测芳姜黄酮的纯度。

2.3.1 室温试验 由于芳姜黄酮为挥发性成分，故将温度设定为室温25℃，放置10 d，然后分别于第0、5、10天取样分析。结果表明，芳姜黄酮在该条件下放置10 d后，外观性状无变化，含有量稳定，见表2。

表2　芳姜黄酮温度试验的结果（峰面积归一化结果，％）

2.3.2 高湿试验 在温度25℃、相对湿度90％下放置10 d，然后分别于第0、5和10天取样分析。结果表明，芳姜黄酮在该条件下放置10 d后，外观性状无变化，含有量稳定，吸湿增重小于5％，见表3。

表3　芳姜黄酮高湿试验（峰面积归一化结果，％）

2.3.3 强光照试验 于照度（4 500±500）1x下放置10 d，然后分别于第0、5和10天取样分析。结果表明，芳姜黄酮在该条件下放置10 d后，外观性状无变化，含有量稳定，见表4。

表4　芳姜黄酮光照试验（峰面积归一化结果，％）

2.4 芳姜黄酮对照品含有量测定色谱条件考察

2.4.1 检测波长考察 利用DAD二极管阵列检测器的全波长扫描功能，对芳姜黄酮供试液进行190～400 nm下的全波长扫描，进行考察。结果表明，供试液在242 nm处有最大吸收，故选择242 nm作为检测波长。

2.4.2 流动相考察 取芳姜黄酮供试液适量，分别以乙腈-水（80∶20）、甲醇-水（80∶20）、甲醇-0.05％磷酸水溶液（80∶20）、甲醇-0.1％磷酸水溶液（80∶20）、甲醇-0.3％磷酸水溶液（80∶20）为流动相，在242 nm下检测，进行考察，结果见表5。由表可知，以甲醇-水（80∶20）为流动相时，对称因子最高。

表5　流动相研究结果

2.4.3 柱温的考察 取芳姜黄酮供试液适量，分别设置柱温为25、30、35℃，进行考察，结果见表6。由表可知，当柱温为25℃时，基线稳定，对称因子最高。

表6　柱温研究结果

2.4.4 流量的考察 取芳姜黄酮供试液适量，分别设置体积流量为0.8、1.0、1.2 mL/min，进行考察，结果见表7。由表可知，当体积流量为0.8 mL/min时，对称因子和理论塔板数最高。

表7　流量研究结果

2.4.5 色谱柱的考察 取芳姜黄酮供试液适量，以检测波长242 nm、柱温25℃、流动相甲醇-水（80∶20）、体积流量0.8 mL/min、进样量10 μL为色谱条件，分别采用Hedera C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）、Agi1ent C8（4.6 mm× 150 mm，5 μm）、Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱进行测定，结果见表8。由表可知，当色谱柱为Hedera C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）时，对称因子和理论塔板数最好。

表8　色谱柱研究结果

2.5 结果 本实验通过反复硅胶柱层析和制备型HPLC法，分离得到芳姜黄酮，其对照品为淡黄色液体，易溶于二氯甲烷和丙酮。然后，对其进行了结构鉴定、纯度检测、稳定性和色谱条件考察。

经EI-MS测定，它与谱库中的芳姜黄酮数据匹配率为98％，而且1H-NMR和13C-NMR测定结果与标准数据一致。

在硅胶GF254薄层板上，经3个展开系统、2种显色方式检测时，均呈现单一斑点，而且未见杂质。然后HPLC检测时发现，芳姜黄酮的色谱峰面积归一化含有量在各波长下均大于99％。

考察了室温、高湿和强光照，分别于第0、5和10 d取样分析。结果表明，芳姜黄酮的外观性状无变化，含有量稳定。

考察了色谱柱、检测波长、流动相、柱温和流量，结果确定色谱条件为Hedera C18色谱柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；检测波长242 nm；流动相甲醇-水（80∶20）；进样量10 μL；柱温25℃；体积流量0.8 mL/min。

3 结论

本实验制备得到的芳姜黄酮对照品的纯度大于99％，符合国家标准要求，而且路线简单可靠，可用于姜黄药材及其制剂的质量控制。

参考文献:

［1］ 汤敏燕，汪洪武，孙凌峰.中药姜黄挥发油化学成分研究［J］.江西师范大学学报（自然科学版），2000，24（8）: 274-277.

［2］ 明·李时珍.本草纲目（校点本）:第2册［M］.北京:人民卫生出版社，1979: 880.

［3］ 陈铁晖，严国鸿，陈 华.姜黄的化学成分及抗肿瘤作用研究进展［J］.海峡预防医学志，2004，10（6）: 23-25.

［4］ 羊 青，晏小霞，王茂媛，等.不同采收期海南姜黄挥发油的GC-MS分析［J］.热带作物学报，2014，35（9）: 1866-1870.

［5］ 李瑞敏，李湘洲，张 胜.姜黄油的不同提取方法及其化学成分的研究［J］.中南林业科技大学学报，2013，33（4）: 114-116.

［6］ 韩 婷，宓鹤鸣.姜黄的化学成分及药理活性研究进展［J］.解放军药学学报，2001，17（2）: 95-97.

［7］ 张印辉，孙 宁.姜黄多种生物活性及其机制的研究进展［J］.中国医药指南，2013，11（9）: 441-442.

［8］ 夏文娟，肖小河，刘峰群，等.国产姜黄属植物的化学成分分析［J］.中国中药杂志，1999，24（7）: 423，424，434.

［9］ A1-Reza S M，Rahman A，Sattar M A，et al.Essentia1oi1com-Position and antioxidant activities of Curcuma aromatica Sa1isb ［J］.Food Chem Toxicol，2010，48（6）: 1757-1760.

［10］ 石雪蓉，顾 健，谭 睿.姜黄挥发油抗肿瘤作用机制研究［J］.中药药理与临床，2003，19（6）: 15-16.

［11］ 高丽红，张玉梅，刘艳霞，等.用GC-MS法分析姜黄和片姜黄中挥发油成分并研究其体外抗肿瘤作用［J］.药学服务与研究，2014，14（1）: 18-21.

［12］ 孙秀燕，李秀琴，王金辉，等.姜黄挥发油抗癌活性成分研究［J］.中草药，2006，37（7）: 982-983.

［13］ Kim D，Suh Y，Lee H，et al.Immune activation and antitumor resPonse of ar-turmerone on P388D1 1ymPhob1ast ce11 imP1anted tumors［J］.Int JMol Med，2013，31（2）: 386-392.

［14］ Negi P S，JayaPrakasha G K，Jagan Mohan Rao L，et al.Antibacteria1 activity of turmeric oi1: a byProduct from curcumin manufacture［J］. J Agric Food Chem，1999，47（10）: 4297-4300.

［15］ Shamim A，A1i M，Shahid H A.Vo1ati1e oi1 comPosition and antimicrobia1activity of Curcuma oligantha var.1utea rhizomes ［J］.Int JRes Ayurveda Pharm，2012，3（5）: 742.

［医院药房］

*通信作者:周 英（1971—），女，教授，博士生导师，从事中药新剂型研究。Te1: 13595102335，E-mai1: yingzhou71@126.com

作者简介:石 洋（1989—），女，硕士，从事天然药物成分及活性生理研究。E-mai1: xiaoyewater@163.com

基金项目:贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目（黔科合中药字［2012］5040）

收稿日期:2014-12-15

中图分类号:R284.1

文献标志码:B

文章编号:1001-1528（2016）02-0464-03