西洋参茎叶皂苷保护大鼠脑缺血再灌注损伤的作用

刘 松， 金梅香， 谭兴文

（吉林省人民医院神经内科，吉林长春130000）



西洋参茎叶皂苷保护大鼠脑缺血再灌注损伤的作用

刘 松， 金梅香， 谭兴文

（吉林省人民医院神经内科，吉林长春130000）

摘要:目的 探讨西洋参茎叶皂苷（PQS）预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。方法 大鼠分别灌胃给予200 mg/（kg·d）和100 mg/（kg·d）PQS，15 d后，采用Longa改良法建立大鼠脑缺血再灌注模型；计算PQS对大鼠神经功能评分及脑梗死面积比的影响，检测PQS对血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-10（IL-10）水平的影响，评价PQS对脑组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含有量的影响。结果 PQS可以降低大鼠神经功能评分及脑组织梗塞面积比（P＜0.05或P＜0.01）；PQS也可以降低血清中TNF-α水平，升高IL-10水平（P＜0.01）；同时，PQS能够升高脑组织中GSH-Px和SOD活性，降低MDA含有量（P＜0.01）。结论 PQS预处理能够有效的减弱脑缺血再灌注导致的损伤，该作用与抑制脑缺血再灌注引起的炎症反应及氧化损伤有关。

关键词:西洋参茎叶皂苷；缺血再灌注；脑；预处理

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.040

脑血管疾病是导致人类死亡的三大病因之一，其中局灶性脑缺血在各类脑血管疾病中最为常见，具有发病率高、致残率高、死亡率高的特点［1］。治疗脑缺血性损伤的首要原则是尽早恢复血液再灌注。而研究发现，脑缺血后的血流恢复可引起脑组织及功能受损，即脑缺血再灌注损伤［2］。因此，预防和治疗脑缺血再灌注损伤已成为防治缺血性脑血管疾病的关键。PQS是西洋参中的主要活性成分，具有增强免疫力、抗肿瘤及抗心肌缺血再灌注损伤等作用，但对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究较少［3］。本研究拟通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，观察PQS对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，并初步探讨其作用机制，为PQS应用于防治缺血性脑血管疾病提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 Wistar大鼠，雄性，体质量（200±20）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京2012-0001）。

1.2 药品和试剂 PQS购于吉林省集安益盛药业股份有限公司，纯度为93％，批号130524；尼莫地平（德国拜耳公司，30 mg/片，批号130522）；TNF-α和IL-10检测试剂盒购自美国R&D公司；GSH-Px、SOD和MDA检测试剂盒采用南京建成生物工程研究所产品；其余试剂为国产分析纯。

1.3 仪器 RM6240型生理记录仪（成都仪器厂）；显微手术器械（浙江宁波医用缝针厂）；UNICO LTV 2000型紫外分光光度计（尤尼柯中国仪器有限公司）。

2 方法

2.1 分组、给药及模型建立 雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组（15 mg/kg）、PQS低剂量组（100 mg/kg）和PQS高剂量组（200 mg/kg），每组8只。PQS给药组连续灌胃给药15 d，1次/d。假手术组与模型组灌胃给予相同体积的生理盐水。

采用Longa改良法［4］建立大鼠脑缺血再灌注模型，灌胃给药15 d后，将麻醉好的大鼠仰卧固定，颈部切口，钝性分离并暴露右侧颈总动脉，在结扎上端距颈总动脉分叉5 mm处剪一小口，插入一尖端光滑、长50 mm、直径0.23 mm，并在22 mm处作标记的尼龙渔线，当感到有轻微阻力并到达标记处时，扎紧并固定尼龙渔线；结扎2 h后，拔出尼龙渔线15 mm进行再灌注；假手术组不插线，其余步骤同上，术中应保持大鼠肛温37～38℃。

2.2 神经功能评分 参照Bederon 4分制评分方法［5］，在实验结束后，对模型大鼠神经功能进行评分。无神经系统损伤症状者记为“0”分；不能完全伸展对侧前爪者记为“1”分；不转圈、伴有前爪屈曲对侧压有抵抗者记为“2”分；向左侧转圈、伴有前爪屈曲对侧压有抵抗者记为“3”分；行走时无自发活动或死亡记为“4”分。

2.3 脑梗塞面积比的计算 断头处死大鼠，将大脑完整取出后，冰冻5 min；经连续2 mm冠状切片后，在2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，2％）溶液中染色，37℃恒温孵育30 min，用多聚甲醛（4％）固定24 h。经TTC染色后，用美国NIH公司的Image J 1.41图像分析软件分别检测着色部分和非着色部分面积，计算脑梗塞面积比。

2.4 血清中TNF-α和IL-10水平检测 实验结束后，颈总动脉取血4 mL，加肝素，1 500 r/min离心10 min，收集血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）法测定TNF-α和IL-10含有量，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.5 脑组织中GSH-Px、SOD活性和MDA含有量检测 实验结束后，断头取脑，取缺血再灌注侧大脑，用滤纸吸去残血，取0.2 g脑组织，剪碎后，冰水浴下加入细胞裂解液，高速匀浆，提取脑组织总蛋白，静置、离心后取上清，采用化学比色法测定脑组织中GSH-Px、SOD活性和MDA含有量。

3 结果

3.1 PQS对大鼠神经功能评分及脑梗塞面积比的影响 尼莫地平组及PQS高、低剂量组与模型组比较，均能显著降低Bederon评分值，改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能障碍（P＜0.01）。大鼠大脑中动脉缺血24 h再灌注2 h后有明显的脑梗塞发生，而尼莫地平组及PQS高、低剂量组均可明显降低缺血再灌注后的脑梗塞面积比，与模型组比较，具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1。

表1　PQS对大鼠神经功能评分及脑梗塞面积比的影响（x ±s，n=8）

3.2 PQS对大鼠血清TNF-α和IL-10水平的影响 尼莫地平组及高、低剂量PQS组均能使缺血再灌注损伤大鼠血清中TNF-α水平下降，与模型组比较，具有显著性差异（P＜0.01）；而与模型组比较，尼莫地平组及高、低剂量PQS组明显升高缺血再灌注损伤大鼠血清中IL-10水平（P＜0.01）。结果见表2。

表2　PQS对大鼠大鼠血清TNF-α和I L-1 0水平的影响（±s，n=8）

表2　PQS对大鼠大鼠血清TNF-α和I L-1 0水平的影响（±s，n=8）

注:与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　剂量/ （mg·kg-1）TNF-α/ （ng·L-1）IL-10/ （ng·L-1）假手术组　　—　7.43±1.43　 263.14±13.39模型组　　—　17.75±2.03##　126.29±13.62##尼莫地平组　15　8.14±1.25**　240.17±16.24**PQS高剂量组　200　9.27±1.38**　217.41±17.45**PQS低剂量组　100　 11.64±1.32**　172.77±20.82**

3.3 PQS对大鼠脑组织中GSH-Px、SOD活性和MDA含有量的影响 尼莫地平组及高、低剂量PQS组均能使缺血再灌注损伤大鼠脑组织GSH-Px和SOD活性升高，与模型组比较，具有显著性差异（P＜0.01）；而与模型组比较，尼莫地平组及高、低剂量PQS组明显降低缺血再灌注损伤大鼠脑组织MDA含有量（P＜0.01）。结果见表3。

表3　PQS对大鼠脑组织GSH-Px、S 0 D活性和MDA含有量的影响（±s，n=8）

表3　PQS对大鼠脑组织GSH-Px、S 0 D活性和MDA含有量的影响（±s，n=8）

注:与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　剂量/（mg·kg-1）　GSH-Px/（U·mg Prot-1）　SOD/（U·mg Prot-1）　MDA/（nmo1·mg Prot-1）假手术组　　—　92.11±6.05　134.78±15.29　5.63±0.96模型组　　—　56.29±7.14##　98.64±12.52##　11.65±1.54##尼莫地平组　15　86.37±6.84**　130.32±14.86**　6.24±0.82**PQS高剂量组　200　81.42±6.57**　124.38±13.33**　6.85±0.86**PQS低剂量组　100　70.13±7.45**　115.17±11.71**　7.16±1.21**

4 讨论

采用线栓法构建局灶性脑缺血再灌注模型，可以很好的模拟人类大脑中动脉阻塞脑卒中的病理过程，该模型由Koizumi首创，并经Longa改良，具有成功率高、操作简单、结果稳定、术后感染少等优点，目前已成为缺血性脑血管病研究中最为常用的经典模型之一［6］。神经功能缺陷评分是建模成功的标志，同时也是反映药物对脑缺血再灌注损伤保护作用的重要指标［7］。本实验采用Bederon 4分制评分方法考察了PQS对脑缺血再灌注大鼠神经功能损害的影响，结果证实，PQS高、低剂量组与模型组比较，均能显著降低Bederon评分值，改善脑缺血再灌注大鼠的神经功能障碍（P＜0.01）。脑梗死面积比是评价脑缺血再灌注损伤最常用的客观指标。TTC染色法是目前国内外学者普遍采用的检测脑缺血再灌注损伤梗死区域的方法［8］。将大鼠脑组织切片放入TTC溶液中，TTC溶液可以使脑梗死灶不染色，呈现苍白色，而正常组织染为红色。本实验结果显示，PQS高、低剂量组可明显降低缺血再灌注后的脑组织梗塞面积比，与模型组比较，具有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。PQS具有益气养心及和血的功效，在临床上主要用于冠心病、心绞痛等疾病的治疗［9-10］。而本研究的结果证实了PQS预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，此结果将为PQS用于缺血性脑血管疾病的防治提供一定的实验依据。

炎症反应是造成脑缺血再灌注损伤的重要原因之一，多种细胞因子和炎症细胞均参与了炎症反应。研究表明［11］，当脑缺血再灌注损伤发生后数小时内，炎症因子表达显著增加，引起脑组织损伤，进而导致氧自由基产生、血管舒缩性改变、细胞毒性酶释放和微血管闭塞等。在脑缺血再灌注损伤中，TNF-α和IL-10等炎症因子的表达量可以直接反应炎症反应的发生水平［12］。本研究结果发现，PQS可以降低脑缺血再灌注模型大鼠血清中TNF-α水平，升高IL-10水平（P＜0.01），此结果表明PQS可以抑制炎症反应的发生。氧化损伤也是目前公认的脑缺血再灌损伤的重要机制之一，缺血可以使ATP匮乏，引起线粒体功能下降，使电子传递链受损，导致活性氧产生增加。GSHPx、SOD活性及MDA含有量与活性氧的产生密切相关，可以反映缺血组织氧化损伤程度［13］。本研究证实，PQS能够提高脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中GSH-Px和SOD活性，降低MDA含有量，表明PQS可以在一定程度上起到抗氧化损伤的作用。

总之，通过以上研究结果表明，PQS预处理能够有效的减弱脑缺血再灌注引起的损伤，该作用与抑制脑缺血再灌注引起的炎症反应及氧化损伤有关。

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作者简介:刘 松（1981—），男，主治医师，从事脑血管病的诊断与治疗研究。Te1:（0431）85595280，E-mai1: 1iusongcc@126.com

收稿日期:2014-12-21

中图分类号:R285.5

文献标志码:B

文章编号:1001-1528（2016）02-0418-04