星点设计-效应面法优化盐巴戟炮制工艺

黄玉秋， 范亚楠， 贾天柱，2，3， 张明璇， 邱一鋆， 史 辑，2，3*

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600；2.国家中医药管理局炮制原理解析重点实验室，辽宁大连116600；3.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁大连116600）



星点设计-效应面法优化盐巴戟炮制工艺

黄玉秋1， 范亚楠1， 贾天柱1，2，3， 张明璇1， 邱一鋆1， 史 辑1，2，3*

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600；2.国家中医药管理局炮制原理解析重点实验室，辽宁大连116600；3.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁大连116600）

摘要:目的 优化盐巴戟的炮制工艺。方法 在单因素试验基础上，以加水量、闷润时间、蒸制时间为自变量，耐斯糖、甲基异茜草素-1-甲醚、水晶兰苷的综合评分为评价指标，通过星点设计-效应面法优选盐巴戟的炮制工艺。结果最佳炮制工艺为加水1.05倍，闷润5.48 h，蒸制2.90 h（100 g巴戟肉加盐1.5 g），测量值和预测值之间的相对误差为3.04％。结论 该方法得到的炮制参数准确，重复性好，有一定实际意义。

关键词:盐巴戟；耐斯糖；甲基异茜草素-1-甲醚；水晶兰苷；星点设计-效应面法

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.028

KEY W 0RDS: sa1ted Morinda officinalis；nystose；rubiadin-1-methy1ether；monotroPein；centra1 comPosite design-resPonse surfacemethodo1ogy

巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效［1］。其中，盐巴戟是巴戟天临床应用最广泛的炮制品种，经盐制后专入肾经，温而不燥，补肾壮阳、强筋骨作用增强［2］，但药典未对其炮制工艺作严格规定，而且文献报道不一［3-6］，致使盐巴戟的内在质量有较大差异。本实验以单因素试验为基础，采用星点设计-效应面法对盐巴戟的炮制工艺进行优化，旨在为其质量评价及临床应用提供科学依据。

星点设计（centra1 comPosite design，CCD）是一种多因素5水平的设计方法，与常用的正交设计法相比，不但具有非线性拟合的特点，而且其结果可以用效应面法（resPonse surface method，RSM）进行优化，能较好地对因变量与自变量的关系进行描述，使最佳试验条件在一个更小的范围内。该方法精密度高，预测值与真实值更接近，而且所用实验次数少，目前在制剂工艺和处方优化中较常用，但鲜见于炮制工艺的筛选［7-10］。本实验将星点设计-效应面法应用到盐巴戟的炮制中，以优选出理想的炮制工艺。

1 仪器与材料

LC-20A型高效液相色谱仪，包括SPD-M20A检测器、SIL-20A自动进样器、CBM-20A系统控制器、LC-20AB泵、LC So1ution LC工作站（日本岛津公司）；Corona CAD电雾式检测器（美国ESA公司）；E2695-2998型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；FA1004型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；AE240型电子分析天平（十万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；100 g手提式高速万能粉碎机（浙江温岭市林大机械有限公司）；RE52CS型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（250 W、40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温干燥箱（上海市跃进医疗器械一厂）。

巴戟天药材购自安徽亳州药材市场，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室翟延君教授鉴定为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥根。

耐斯糖对照品（批号292-64121，纯度≥99.0％，日本Wako公司）；水晶兰苷对照品（批号MUST-11062204，纯度≥98.0 ％，成都曼斯特生物科技有限公司）；甲基异茜草素-1-甲醚（自制，纯度＞95 ％）。食盐（延吉高丽亚食品经销部）；水为超纯水；乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 药材的准备 巴戟天用1.0倍量水浸泡，50℃下闷润9 h，去除木心，切段10～15 mm，干燥。然后，以此工艺得出的巴戟肉来制备盐巴戟。

2.2 耐斯糖的含有量测定［1，11-12]

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取耐斯糖对照品128 mg，甲醇∶水（3∶97）定容至500 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.2.2 色谱条件 Ecosi1C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 mm），包括Corona CAD电雾式检测器；流动相为甲醇∶水（3∶97）；体积流量1.0 mL/min；进样量5 μL；柱温30℃，见图1。

2.2.3 供试品溶液的制备及样品测定 精密称取不同炮制方法制得的盐巴戟粉末（过60目筛）0.5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入乙酸乙酯30 mL，超声（250 W、40 kHz）处理30 min，过滤，弃去滤液，挥干，滤渣再加70％乙醇50 mL，相同条件下超声处理，过滤，回收乙醇，用甲醇-水（3∶97）定容至25 mL量瓶中，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。在“2.2.2”项条件下进行操作，测得峰面积，计算含有量。

2.3 水晶兰苷的含有量测定［12]

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取水晶兰苷对照品15.8 mg，80％甲醇定容至50 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.3.2 色谱条件 Venusi1 MP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 mm）；流动相为甲醇-0.1 ％磷酸水溶液，梯度洗脱（5∶95→28.8∶71.2，15 min）；检测波长235 nm；体积流量0.8 mL/min；进样量2 μL；柱温25℃，见图2。

2.3.3 供试品溶液的制备及样品的测定 精密称取不同炮制方法制得的盐巴戟粉末（过60目筛）1 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，加入80％甲醇100 mL，冷浸1 h，超声（250 W、40 kHz）处理1 h，过滤，80 ％甲醇定容至10 mL量瓶中，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。在“2.3.2”项条件下进行操作，测得峰面积，计算含有量。

2.4 甲基异茜草素-1-甲醚的含有量测定［13]

2.水晶兰苷2.monotroPein图2　水晶兰苷对照品及样品的H P L C色谱图Flg.2 HPLC chromatograms of monotropeln reference substance and samp le

2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取甲基异茜草素-1-甲醚对照品2.93 mg，置于5 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得。

2.4.2 色谱条件 Ecosi1C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 mm）；流动相为乙腈-0.2％磷酸水溶液，梯度洗脱（20∶80→42∶58，15 min；60∶40 →95∶5，5 min）；检测波长277 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量20 μL；柱温30℃，见图3。

3.甲基异茜草素-1-甲醚3.rubiadin-1-methy1ether图3　甲基异茜草素-1-甲醚对照品及样品的HP LC色谱图Flg.3 HPLC chromatograms of rubladln-1-methylether reference substance and sample

2.4.3 供试品溶液的制备及样品的测定 称取不同炮制方法制得的盐巴戟粉末（过60目筛）2 g，置于150 mL圆底烧瓶中，加氯仿80 mL，回流提取两次，每次2 h，合并滤液，甲醇定容至10 mL量瓶中，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。在“2.4.2”项色谱条件下，得到相应的峰面积，计算含有量。

2.5 单因素试验

2.5.1 加盐量 取“2.1”项下巴戟肉5份，每份30 g，分别加入0.3、0.45、0.6、0.75、0.9 g盐进行炮制，按上述方法测得耐斯糖、水晶兰苷、甲基异茜草素-1-甲醚的含有量，以加权综合评分OD值为指标进行评价（综合评分OD=0.4X/Xmax+0.3Y/Ymax+0.3Z/Zmax，X为耐斯糖测定值，Y为水晶兰苷测定值，Z为甲基异茜草素-1-甲醚测定值，Xmax、Ymax、Zmax分别为各自对应的最大测定值），满分是1.0分。结果，综合评分OD值分别为0.848、0.933、0.864、0.765、0.792分，故药材加盐0.45 g最好。

2.5.2 加水量 取“2.1”项下巴戟肉5份，每份30 g，各加盐0.45 g，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0倍量的水进行炮制，HPLC法测得3种指标性成分的含有量，按“2.5.1”项下方法进行评价。结果，OD值在加水量为1.0倍量时最高，而且低于0.8倍量时，药材不能完全软化，故在星点设计时，中值水平设定为1.0倍量。

2.5.3 闷润时间 取“2.1”项下巴戟肉5份，每份30 g，加1.5 ％盐水30 mL，分别闷润3、4、5、6、7 h后，再蒸制2 h，干燥，对不同闷润时间进行筛选，发现闷润5 h效果最好。另外，当闷润时间低于4 h时，水分剩余较多，不能完全吸收，故在星点设计时，将闷润时间的最小水平设定为4 h。

2.5.4 蒸制时间 取“2.1”项下巴戟肉5份，每份30 g，加1.5 ％盐水30 mL，闷润5 h，分别蒸制0.5、1、1.5、2、3 h，干燥，HPLC法测得3种指标性成分的含有量，计算综合OD值。结果，最佳蒸制时间为3 h。

2.6 星点设计效应面法优化制备工艺

2.6.1 星点设计试验 在单因素试验的基础上，根据星点设计原理，选择加水量（A，倍）、闷润时间（B，h）、蒸制时间（C，h）作为考察因素，每个因素设定5个水平，以加权综合评分OD值为指标（计算方法同“2.5.1”项）。试验因素水平见表1，结果见表2。

表1　因素水平Tab.1 Factors and levels

表2　试验结果Tab.2 Results of tests

2.6.2 模型拟合 根据试验结果，用Design-Ex-Pert.V8.0.6.1软件并以总评OD值为因变量，对自变量进行回归分析，得到回归方程Y=-15.200 6 +14.067 4A+1.912 9B+2.427 3C-0.068AB+ 0.539 7AC+0.015 6BC-7.297 8A2-0.172 2B2-0.53C2（r=0.912 6，P=0.000 3），r较大，说明模型拟合度高，预测性较好。方差分析见表3，可见A（加水量）和C（蒸制时间）对总评OD值的影响较为显著（P＜0.05）。

表3　方差分析Tab.3 Analysls of varlance

2.6.3 效应面优化与预测性评价 根据所拟合的回归方程，应用Design-ExPert.V8.0.6.1软件，分别绘制总评OD值与影响较显著的两个因素的三维效应面，确定最佳工艺区域，筛选最佳炮制工艺，见图4。

图4　各因素的三维效应面Flg.4 Three-d lmenslonal response surfaces of varlous factors

由图可知，在A、B两个因素中，随着A（加水量）的增加，曲面慢慢变得陡峭，而B（闷润时间）对曲面影响较小，随着其改变，曲面较平滑；在A、C两个因素中，随着两者的增加，总评OD值也在增加，直到达到一个最大值；B、C两因素跟A、C较相似。由此表明，A和C影响较显著，而B影响较小。

2.6.3 验证试验 采用Design-ExPert.V8.0.6.1软件计算，结合生产实际，得出盐巴戟的最佳炮制工艺为加水1.05倍量，闷润5.48 h，蒸制2.90 h （100 g巴戟肉加盐1.5 g）。按照筛选出的最优炮制工艺条件重复3次，得出平均实际测定值（0.913 9），与理论预测值（0.942 6）的相对误差为3.04％（相对误差=［预测值-实际值］/预测值），小于5％，说明星点设计-效应面法得到的盐巴戟炮制工艺技术参数准确可靠，重复性好，可用于实际生产。

3 讨论

盐巴戟的补肾壮阳、强筋骨作用相比巴戟肉有所增强，原因是其在炮制过程中，化学成分发生了变化。目前认为，巴戟天寡糖具有补肾壮阳、抗衰老、抗抑郁以及提高细胞免疫的功能，而耐斯糖是其中含有量较高的成分，《中国药典》2010版中就是以耐斯糖的含有量变化来评价巴戟天质量的优劣。另外，巴戟天中具有抗风湿作用的环烯醚萜苷类成分，如水晶兰苷等具有明确的抗炎和镇痛作用，而甲基异茜草素-1-甲醚等茜草素型蒽醌可能是其发挥补益作用的物质基础。由于巴戟天经盐蒸后，耐斯糖、水晶兰苷、甲基异茜草素-1-甲醚的含有量均有所增加［12］，因此以这3个成分为指标，对盐巴戟炮制工艺进行优化，客观科学地评价其饮片质量，提高其在临床上的药效。

本实验选择星点设计-效应面法，用非线性数学模型对模型进行拟合，用三维效应面进行优化，可直接看出最佳效应区域。该方法具有较高的可靠性，得到的最佳工艺条件稳定精密，而且重复性好，比常用的正交设计更直观形象，说明其应用于巴戟天的炮制工艺研究是有效可行的。

参考文献:

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典: 2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010: 75.

［2］ 崔 妮，史 辑，贾天柱.巴戟天不同炮制品补肾壮阳作用的比较研究［J］.中国中药杂志，2013，38（22）: 3898-3901.

［3］ 胡昌江，周弋芠，李金连，等.盐炙巴戟天工艺研究［J］.中成药，2009，31（12）: 1890-1893.

［4］ 许冬瑾，伍小妹，黄 云，等.鲜巴戟天盐制工艺［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（12）: 50-52.

［5］ 王成永，金传山，吴德玲，等.盐巴戟天炮制工艺改进实验及质量标准研究［J］.安徽中医学院学报，2005，24 （4）: 46-47.

［6］ 邹 兵，马雪松，佟连琨，等.盐巴戟天炮制工艺的优化［J］.中国医药指南，2010，8（34）: 223-226.

［7］ 史亚军，王昌利，赵海峰，等.星点设计-效应面法优选止鼾颗粒成型工艺［J］.中成药，2014，36（9）: 1863-1866.

［8］ 朱可馨，王志成，王 冰，等.白藜芦醇固体脂质纳米粒的处方和制备工艺优化［J］.中成药，2015，37（2）: 409-412.

［9］ 石庆平，张志涛，丁 峰，等.星点设计-效应面法优化薯蓣总皂苷口腔崩解片处方［J］.中成药，2014，36（12）: 2508-2511.

［10］ 符少莲，冯翠娟，李 莎.星点设计-效应面法优化脂溶性丹参提取物速释滴丸处方工艺［J］.中成药，2013，35 （4）: 690-695.

［11］ 景海漪，史 辑，崔 妮，等.巴戟天炮制前后寡糖类成分HPLC-CAD指纹图谱研究［J］.中草药，2014，45（10）: 1412-1417.

［12］ 景海漪，史 辑，崔 妮，等.不同炮制方法对巴戟天中寡糖类成分和水晶兰苷含量的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2014，20（17）: 20-23.

［13］ 崔 妮，史 辑，贾天柱.巴戟天不同炮制品HPLC指纹图谱研究［J］.中草药，2014，45（13）: 1871-1875.

0 ptlm lzatlon of the processlng procedure of salted Morinda officinalis by central com poslte deslgn-reponse surfacemethodology

HUANG Yu-qiu1， FAN Ya-nan1， JIA Tian-zhu1，2，3， ZHANG Ming-xuan1， QIU Yi-yun1，SHI Ji1，2，3*
（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；2.Key Laboratory of Processing PrinciPle Analysis，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；3.Liaoning Research Center of Processing Engineering Technology for Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

ABSTRACT:AIM To oPtimize the Processing Procedure of sa1ted Morinda officinalis.METH0 DS On the basis of sing1e factor exPeriment，water addition，moistening time and steaming time were taken as indePendent variab1es.The comPrehensive scores of nystose，rubiadin-1-methy1ether and monotroPein were taken as eva1uation indexes.Then centra1 comPosite design-resPonse surface methodo1ogy was aPP1ied to oPtimizing the Processing Procedure of sa1ted Morinda officinalis.RESULTS The oPtimized Processing Procedure was 1.05 times forwater addition，5.48 hours formoistening time and 2.9 hours for steaming time（100 g Morinda officinalis was added with 1.5 g sa1t）.The re1ative error between themeasured va1ue and forecast va1uewas3.04％.C0NCLUSI0N The Processing Parameters obtained by thismethod are accuratewith good reProducibi1ity，having a certain Practica1significance.

*通信作者:史 辑（1977—），女，副教授，硕士生导师，从事中药炮制化学研究。Te1:（0411）85890146，E-mai1: 1nshiji@ 163.com

作者简介:黄玉秋（1989—），女，硕士，从事中药炮制原理研究。Te1:（0411）85890157，E-mai1: hyq198996@126.com

基金项目:国家自然科学基金青年基金（81001635）；国家自然科学基金（81473350）

收稿日期:2015-06-29

中图分类号:R283

文献标志码:A

文章编号:1001-1528（2016）02-0361-05