HPLC法同时测定三味龙胆花片中龙胆苦苷及獐牙菜苦苷

余继英， 吴 亮， 徐傅能， 张静波， 陈 瑾， 何 林*

（1.四川省医学科学院，四川省人民医院药学部，四川成都610072；2.西南交通大学，四川成都610000；3.四川宇妥藏药药业有限公司，四川成都610000）



HPLC法同时测定三味龙胆花片中龙胆苦苷及獐牙菜苦苷

余继英1， 吴 亮2， 徐傅能2， 张静波3， 陈 瑾1， 何 林1*

（1.四川省医学科学院，四川省人民医院药学部，四川成都610072；2.西南交通大学，四川成都610000；3.四川宇妥藏药药业有限公司，四川成都610000）

摘要:目的 建立HPLC法同时测定三味龙胆花片（白花龙胆、甘草、蜂蜜）中龙胆苦苷及獐牙菜苦苷的含有量。方法 药物甲醇提取液的分析采用Diamonsi1C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温30℃；流动相为甲醇-水（25∶75）；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL；检测波长240 nm。结果 龙胆苦苷和獐牙菜苦苷分别在20.1～201.0 ng（r=0.999 9）和19.76～197.6 ng（r=0.999 9）范围内有良好的线性关系，平均加样回收率分别为99.93％ 和100.8％，RSD值分别为1.65％和2.06％。结论 该方法简便、准确、可靠，可用于三味龙胆花片的质量控制。

关键词:三味龙胆花片；龙胆苦苷；獐牙菜苦苷；HPLC

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.018

KEY W 0RDS: Sanwei Longdanhua Tab1ets；gentioPicroside；swertiamarin；HPLC

藏药三味龙胆花片是由白花龙胆（即高山龙胆的干燥花）、甘草及蜂蜜所组成的复方制剂，具有清热、润肺功能，主要用于治疗肺热气喘、咽喉炎，但原标准仅有以龙胆苦苷为对照的薄层鉴别及甘草酸的含有量测定［1］。本实验根据处方组成并参考相关文献［2-14］，建立了同时测定三味龙胆花片中龙胆苦苷及獐牙菜苦苷含有量的HPLC方法，以期更加全面地评价其质量，并为进一步研究提供参考。

1 仪器与试药

Waters 600高效液相色谱仪，配备Waters 717自动进样器、SPD-10A检测器、Waters EmPower色谱工作站（美国Waters公司）；Sartorius-BP211D分析天平（德国赛多利斯公司）。

龙胆苦苷（批号110770-201013，纯度96.9％）、獐牙菜苦苷（批号130514，纯度98％）对照品（中国食品药品检定研究院）。三味龙胆花片（四川宇妥藏药药业有限公司，批号140501、140701、140901）。甲醇为色谱纯（美国Dikma公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件和系统适用性实验 Dikma Diamonsi1C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（25∶75）；检测波长240 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温30℃。理论塔板数按龙胆苦苷及獐牙菜苦苷色谱峰计算，均不低于3 000。龙胆苦苷及獐牙菜苦苷对照品、供试品及阴性样品溶液的色谱图见图1。

A.对照品 B.供试品 C.阴性样品1.獐牙菜苦苷 2.龙胆苦苷A.reference substances B.samP1es C.negative samP1e 1.swertiamarin 2.gentioPicroside图1　三味龙胆花片HP L C色谱图Flg.1 HPLC chromatograms of Sanwel Longdanhua Tablets

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取龙胆苦苷、獐牙菜苦苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为1.005 mg/mL和0.987 8 mg/mL的溶液，即得储备液。再分别精密量取两种贮备液适量，置于10 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即得分别含龙胆苦苷和獐牙菜苦苷10.05 μg/mL和9.878 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取三味龙胆花片10片，除去薄膜衣，研细，精密称取0.5 g，精密加入甲醇20 mL，称定质量，加热回流15 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，取5 mL置于离心管，4 000 r/min离心5 min，精密量取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 阴性供试品溶液 按三味龙胆花片的处方和制法制备阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备阴性供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线及线性范围 精密吸取混合对照品溶液2、4、6、8、10、12、15、18、20 μL，注入色谱仪，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得到回归方程，见表1。

表1　两种成分回归方程Tab.1 Regresslon equatlons of two constltuents

2.3.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，以峰面积为指标进行考察。结果，龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的RSD分别为0.2％、0.3％（n =6），表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一样品，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，进样测定。结果，RSD分别为1.86％、1.17％（n =6），表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一对照品溶液适量，分别在0、2、4、6、8、12 h进样测定。结果，龙胆苦苷和獐牙菜苦苷峰面积的RSD分别为1.45％和1.11％，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率 精密称取含有量已知的3味龙胆花片样品粉末0.25 g，共9份，分别加入龙胆苦苷和獐牙菜苦苷储备液适量，使其最终含有量约为样品的80％、100％和120％，每个水平各3份，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，进样测定，结果见表2。

表2　加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of recovery tests（n=9）

2.4 样品测定 取3个批号的样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每批平行3份，在“2.1”项色谱条件下进样10 μL，记录峰面积，外标法计算两组分含有量，结果见表3。

表3　样品测定结果（±s，n=3）Tab.3 Determ lnatlon results of samp les（±s，n=3）

表3　样品测定结果（±s，n=3）Tab.3 Determ lnatlon results of samp les（±s，n=3）

样品批号　龙胆苦苷/（mg·g-1）　獐牙菜苦苷/（mg·g-1）140501　3.615±0.093　4.144±0.110 140701　2.876±0.067　3.768±0.051 140901　3.215±0.048　4.553±0.088

3 讨论

根据制剂处方特点和指标成分理化性质，以不同比例甲醇（25％、50％、100％）为溶剂，考察了不同提取方法（超声、加热回流）和不同提取时间（15 min、30 min、1 h）的提取效率，同时以滤过和离心两种方式处理供试液。结果，超声提取效率较低，而加热回流不同时间下的提取效率无显著差异，另外提取物直接离心处理时的重复性更好，操作也更方便。

参照文献，考察了甲醇-水和乙腈-水系统的分离效果，综合考虑出峰时间、峰形等因素，最终选用流动相为甲醇-水（25∶75）。

3批样品指标成分的含有量有一定差异，这可能由于原料产地、采收时间等因素的不同［15］。而且，对指标成分进行控制，有助于产品质量的全面评价，并为进一步的体内研究打下基础。

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Slmultaneous determ lnatlon of gentloplcroslde and swertlamarln ln Sanwel Longdanhua Tablets by HPLC

YU Ji-ying1， WU Liang2， XU Fu-neng2， ZHANG Jing-bo3， CHEN Jin1， HE Lin1*
（1.Sichuan Provincial Academy of Medical Sciences，DePartment of Pharmacy，Sichuan Provincial PeoPle' s HosPital，Chengdu 610072，China；2.Southwest Jiaotong University，Chengdu 610000，China；3.Sichuan Yutuo Tibetan Pharmaceutical Co.，Ltd.，Chengdu 610000，China）

ABSTRACT:AIM To estab1ish an HPLCmethod for the simu1taneous determination of gentioPicroside and swertiamarin in Sanwei Longdanhua Tab1ets（Gentian algida，Glycyrrhiza uralensis and honey）by HPLC.METH 0 DS The ana1ysis of methano1ic extract of this drug was Performed on Diamonsi1C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm），with co1umn temPeraturemaintained at30℃，metho1-H2O（25∶75）asmobi1e Phase at a f1ow rate ofbook=319,ebook=971 mL/min and detection wave1ength set at 240 nm.RESULTS The 1inear ranges were 20.1 -201.0 ng （r=0.999 9）for gentioPicroside and 19.76 -197.6 ng（r=0.999 9）for swertiamarin，whose average recoveries were 99.93％ and 100.8％ with the RSDs of 1.65％ and 2.06％，resPective1y.C0NCLUSI0 N This simP1e and accuratemethod is re1iab1e for the qua1ity contro1of Sanwei Longdanhua Tab1ets.

*通信作者:何 林，男，博士，研究员，硕士生导师，从事新制剂及其药动学研究。Te1:（028）87393932，E-mai1: he1inn@tom.com

作者简介:余继英（1963—），女，硕士，主任药师，从事药物制剂质量研究。Te1:（028）87393316，E-mai1: yujiying@163.com

基金项目:四川省科技支撑计划（2012SZ0182）

收稿日期:2015-05-13

中图分类号:R927.2

文献标志码:A

文章编号:1001-1528（2016）02-0318-04