通络救脑注射液及其组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3表达及其功能的影响

马家宝，李兴广，李卫红，徐 雅，张 赛，姜昭妍，胡艳红，苏 靖，张 凡，王 磊

(北京中医药大学，北京 100029)

通络救脑注射液及其组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3表达及其功能的影响

马家宝，李兴广△，李卫红△，徐 雅，张 赛，姜昭妍，胡艳红，苏 靖，张 凡，王 磊

(北京中医药大学，北京 100029)

目的:观察通络救脑注射液及其有效组分对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞谷氨酸受体3(glutamate receptor 3，GluR3)表达及其功能的影响。方法:采用大鼠原代培养脑微血管内皮细胞，氧糖剥夺法制备拟缺血模型，分别用通络救脑注射液及其2组分栀子苷、三七总皂苷对细胞进行干预，采用PCR和免疫蛋白印迹法检测各组细胞中GluR3 mRNA及蛋白表达水平，并用免疫蛋白印迹法检测GluR3调节的下游分子基质金属蛋白酶诱导因子CD147、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的蛋白表达情况。结果:通络救脑注射液及其组分能够从基因到蛋白水平显著下调GluR3的表达，对CD147、MMP-9也有显著下调作用，且通络救脑注射液疗效优于2组分。结论:通络救脑注射液及其组分可调节拟缺血损伤脑微血管内皮细胞GluR3的表达及其功能，这可能是其在脑缺血性损伤中保护血脑屏障、减轻炎症反应的机制之一。通络救脑注射液效果优于2组分，显示了复方配伍发挥整合调节的疗效优势。

通络救脑注射液;脑微血管内皮细胞;GluR3;CD147;MMP-9

通络救脑注射液是基于“毒损脑络”病机理论研发的一种用于缺血性中风急性期的中药复方新药。前期药理研究显示，该药可通过多种途径抑制脑缺血的发生与发展，对脑微血管内皮细胞具有明显的保护作用［1-2］。利用基因芯片技术对该药的靶基因进行筛选，我们发现通络救脑注射液对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞谷氨酸受体3(glutamate receptor 3，GluR3)的mRNA具有显著下调作用。因此，本实验在前期研究基础上，以该注射液的2个有效组分栀子苷和三七总皂苷作为对照，观察了通络救脑注射液对拟缺血脑微血管内皮细胞 GluR3 mRNA和蛋白表达的影响，以及对GluR3调节的下游相关蛋白 CD147、基质金属蛋白酶 9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表达的调节作用，以深入揭示通络救脑注射液发挥血管保护作用的分子靶点，同时阐释该复方新药的配伍优势。

1 实验方法

1.1 细胞的原代培养与传代

采用本室已建立的脑微血管内皮细胞培养方法［3］，选取SD大鼠进行细胞取材、分离纯化和培养，实验用第3代细胞。

1.2 制备拟缺血损伤模型

本室已建立糖氧剥夺模型［4］，将第3代细胞置于无糖的Kreb’s液中，在三气培养箱中模拟低氧环境(气体设为94%N2，5%CO2，1%O2)培养6 h。

1.3 分组与处理

通络救脑注射液由中药栀子、三七组分配伍而成，故本研究中以2种组分栀子苷和三七总皂苷作为对照。将细胞分成正常组、模型组、栀子苷组、三七总皂苷组、通络救脑注射液组5组。除正常组外，各组均按上述方法造模，在造模前3 h及造模过程中给药，栀子苷组的终浓度为33.2 μg/ml(与通络救脑注射液组中栀子苷的终浓度相同);三七总皂苷组终浓度为22 μg/ml(与通络救脑注射液组中三七总皂苷的终浓度相同);通络救脑注射液按4 μL/ ml给药，处理结束后进行以下指标检测。

1.4 PCR法检测GluR3 mRNA表达水平

各组细胞加Trizol后提总RNA，测定RNA浓度。用逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，在7500型PCR仪上检测GluR3基因的mRNA表达水平，表达变化倍数采用2-ΔΔCt算法。计算公式:ΔCt =Ct目的基因–Ct内参;ΔΔCt=ΔCt实验组–ΔCt对照组。PCR引物如下:GluR3:F:AACGATACTTG ATTGACTGTGAA，R:ATGTAGTGATAGCCTCTTG AATG;内参 β-actin:F:TATCGGCAATGAGCGG TTCC，R:AGCACTGTGTTGGCATAGAGG。

1.5 Western blotting法检测各组 GluR3、CD147、MMP-9的表达

各组细胞处理完毕后，加入裂解液收集细胞，并用细胞破碎机进行破碎，4℃离心后取上清，BCA法进行蛋白定量。配制聚丙烯酞胺凝胶后将蛋白样品上样，凝胶电泳后转膜(PVDF)，用5%脱脂奶粉封闭1 h，洗膜后加入相应的一抗4℃过夜。次日洗膜后加入相应二抗孵育，ECL显色、照相，并进行灰度值定量分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 通络救脑注射液及其组分对拟缺血脑微血管内皮细胞GluR3 mRNA的影响

图1显示，与正常组比较，模型组GluR3 mRNA水平明显增高(P＜0.05)，提示氧糖剥夺可诱导GluR3 mRNA的高表达;与模型组比较，各给药组GluR3 mRNA表达均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，3给药组之间比较差异无统计学意义。

2.2 通络救脑注射液及其组分对拟缺血脑微血管内皮细胞GluR3蛋白表达的影响

图1 各组脑微血管内皮细胞GluR3 mRNA的表达

图2显示，Western blotting检测GluR3蛋白表达情况。与正常组比较，造模后GluR3的表达量显著增多(P＜0.01)，与模型组比较，各给药组GluR3蛋白表达显著下降(P＜0.01)，提示通络救脑注射液和2组分均可下调GluR3蛋白表达;与栀子苷组、三七总皂苷组比较，通络救脑注射液组GluR3表达下降更为明显(P＜0.01，P＜0.05)，提示注射液的疗效优于2组分单独作用。

图2 各组脑微血管内皮细胞GluR3的蛋白表达

2.3 通络救脑注射液及其组分对拟缺血脑微血管内皮细胞CD147蛋白表达的影响

图3显示，与正常组比较，模型组CD147表达量显著增多(P＜0.01);与模型组比较，各给药组CD147蛋白表达均明显下降(P＜0.05，P＜0.01)，提示通络救脑注射液及其组分均可抑制CD147的表达，其中通络救脑注射液的下调作用优于三七总皂苷(P＜0.05)。

2.4 通络救脑注射液及其组分对拟缺血脑微血管内皮细胞MMP-9蛋白表达的影响

图4所示，与正常组比较，模型组细胞MMP-9的表达量增多(P＜0.05);与模型组比较，各给药组MMP-9表达均显著降低(P＜0.01)，提示通络救脑注射液及其组分均可抑制MMP-9的表达，通络救脑注射液对MMP-9的下调作用优于栀子苷(P＜0.05)。

图3 各组脑微血管内皮细胞CD147的蛋白表达

图4 各组脑微血管内皮细胞MMP-9的蛋白表达

3 讨论

脑缺血时谷氨酸大量释放，其受体被激活，可从多种途径造成脑损伤。离子型谷氨酸受体AMPA (amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid)是由4个亚单位GluR1～GluR4构成的同聚体或异聚体［5］。GluR3是AMPA的一个重要亚型，传统认为它主要存在于神经元、星形胶质细胞中，激活后会导致大量的Na+内流，在中枢神经系统内主要介导快速兴奋性突触传递。相关研究表明，其基因功能异常可引起神经元损害，表现为智力缺陷及癫痫，参与神经性头痛［6］。近年来，谷氨酸及其受体在其他组织或细胞的表达及功能得到越来越多的关注，如在人类T细胞中GluR3活化后会诱导T细胞的黏附和趋化性迁移［7］，提示其参与更广泛的生理病理过程。但该受体在脑微血管内皮细胞的表达鲜有报道。前期用基因芯片技术进行差异基因筛选时发现，缺血损伤后脑微血管内皮细胞GluR3 mRNA表达明显升高。故本实验采用PCR和Western blotting技术检测GluR3在脑微血管内皮细胞中的表达情况。结果显示，GluR3可表达于脑微血管内皮细胞，拟缺血损伤后表达明显上调，提示该受体可能参与缺血后的血管损伤。

Ganor等在对GluR3功能研究中发现，该受体在癌症T细胞中会激发CD147的表达［8］。CD147是一种基质金属蛋白酶诱导因子，可通过自分泌或旁分泌的方式诱导MMP-9的产生。MMP-9是一种降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)分子的中性蛋白酶，可降解细胞外基质。在脑缺血过程中，既参与血脑屏障的损伤［9］，又作为炎症相关因子促进炎症的发展［10］。从结果可以看出，缺血性损伤后脑微血管内皮细胞GluR3、CD147和MMP-9表达均显著上调，提示缺血诱导了该信号通路的活化，导致终产物MMP-9的高表达。这可能是缺血后血脑屏障的破坏和炎症反应加重的内在机制之一。

通络救脑注射液是由栀子和三七配伍组成，具有解毒通络的功能，在缺血性中风治疗中发挥了良好的治疗作用，但其药理机制并不明确。本实验结果显示，通络救脑注射液及其2组分栀子苷、三七总皂苷对拟缺血脑微血管内皮细胞GluR3具有明显的下调作用，且通络救脑注射液的作用更为明显。同时通络救脑注射液及其2组分对GluR3的下游分子CD147、MMP-9也有显著下调作用，提示对该信号通路的调节可能是注射液保护内皮功能、维持血脑屏障稳定、减轻炎症反应的内在机制，也可能是该复方发挥“解毒通络”作用的现代生物学基础。同时通络救脑注射液的治疗作用在不同程度上优于其单一组分，体现了中药复方配伍发挥整合调节的疗效优势。

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The Effects of Tong Luo Jiu Nao Injection and its Components on the Expression and Function of GluR3 in Mimic Ischemic Brain Microvascular Endothelial Cells

MA jia-bao，LI wei-hong△，LI xing-guang△，XU ya，ZHANG sai，KANG soyeon，HU yan-hong，SU jing，ZHANG fan，WANG lei
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective:To study the effects of Tong Luo Jiu Nao injection(TLJN)and its active components on the expression and function of Glutamate receptor 3(GluR3)in mimic ischemic brain microvascular endothelial cells (BMECs)．Methods:Primary rat BMECs were used and mimic cerebral ischemia in vitro was established by oxygenglucose-deprived(OGD)method．OGD-induced BMECs were treated with Geniposide，Panax notoginseng saponins(PNS) and TLJN respectively．The expression of GluR3 in mRNA and protein level was detected using RT-PCR and Western blot methods．The expression of CD147 and matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in various groups were detected by Western blot．Results:The expression of GluR3 in OGD-induced BMECs was down-regulated by TLJN and its components geniposide，PNS．The expression of CD147 and MMP-9 were also decreased in administration groups．Effect of TLJN was superior to geniposide or PNS．Conclusion:TLJN and its components could regulate the expression and function of GluR3 in mimic ischemic BMECs，which may be the internal mechanism of TLJN’s effect on Blood Brain Barrier damage and inflammation in cerebral ischemia．Meanwhile，TLJN had more optimized effect than its active components，which showed the therapeutic advantages of Chinese medicine compatibility．

Tong Luo Jiu Nao injection;brain microvascular endothelial cells;GluR3;CD147;MMP-9

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0200-03

2015-07-15

马家宝(1988-)，女，在读硕士，从事中药复方的配伍机制研究。

△通讯作者:李兴广，男，教授，主任医师，硕士研究生导师，Tel:13621008162，E-mail:lixingguang@hotmail．com;李卫红，女，副教授，主治医生，硕士研究生导师，Tel:15001221959，E-mail:liweihong．403@163．com。