栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬及凋亡的影响*

唐丹丽，刘寨华，崔海峰，周艳华，隋 宇，张华敏

(1．中国中医科学院医学实验中心，北京 100700;2．中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;3．中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700)

栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌自噬及凋亡的影响*

唐丹丽1，刘寨华2，崔海峰1，周艳华1，隋 宇1，张华敏3△

(1．中国中医科学院医学实验中心，北京 100700;2．中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;3．中国中医科学院中医药信息研究所，北京 100700)

目的:观察栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)大鼠心肌自噬及凋亡的影响。方法:将40只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、3-MA干预组及栝楼薤白半夏汤组，采用可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min、再灌注2 h复制MI/RI模型。利用全自动生化仪检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)含量，采用Western blot法测定心肌自噬基因Beclin-1、LC3II及促凋亡蛋白Bax表达水平。结果:与假手术组比较，模型组大鼠血清CK、LDH含量与心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表达及LC3 II/LC3I水平均显著升高，与模型组比较，栝楼薤白半夏汤组及3-MA干预组能降低血清CK、LDH含量，下调心肌Beclin-1、LC3 II、Bax蛋白表达及LC3 II/LC3I水平，且栝楼薤白半夏汤抑制Beclin-1表达作用优于3-MA干预组。结论:心肌缺血再灌注可引起自噬反应增强，促进凋亡损伤，栝楼薤白半夏汤通过抑制自噬、改善心肌细胞凋亡而起到心肌保护作用。

心肌缺血再灌注损伤;自噬;凋亡;栝楼薤白半夏汤

自噬(autophagy)是广泛存在于真核细胞生物中的一种细胞自我吞噬现象，在正常生理状态下，自噬能够清除衰老的细胞器及降解异常积聚的蛋白质，从而保持机体内环境的稳定;当缺氧或营养物质缺乏时，自噬可通过降解胞内物质产生氨基酸和脂肪酸为机体提供能量，并促进机体蛋白和细胞器的合成。诸多证据显示［1-2］，自噬参与心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)过程，并在MI/RI病理进程中扮演重要角色。

中医药对MI/RI保护作用的研究是近年来中西医结合研究的切入点之一，如何在治疗该病的有效治法方药中系统地进行筛选并研究其作用机制，对发掘传统中药方剂的临床实用价值、阐明中药科学内涵有积极的推动作用。栝楼薤白半夏汤出自东汉医家张仲景所著《金匮要略》，是治疗胸痹的名方，具备通阳散结、祛痰宽胸之功效，是临床常用于治疗心血管疾病的有效方剂。课题组前期研究显示［3］，该方具有抑制再灌注后 NF-кB信号通路活化、减轻炎症损伤的作用。本研究旨在明确其对MI/RI过程中心肌自噬及凋亡的影响，以期进一步阐明该方对再灌注损伤心肌的保护作用。

1 材料

1.1 动物

雄性SD大鼠40只，体质量(250±20)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号SCXK-(军)2012-0004)。

1.2 药物

栝楼薤白半夏汤组成:栝楼24 g，薤白9 g，半夏12 g，白酒24 L［4］，所有药材由北京同仁堂(亳州)饮片有限责任公司提供。药物剂量换算依70 kg成人每日1剂原方用量，换算出大鼠每日用量，浓缩成含生药1.3 g/ml的水煎液。

1.3 主要试剂与仪器

CK、LDH试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司;自噬抑制剂、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)Sigma公司产品;Bax抗体，Cell Signaling Technology公司产品;辣根过氧化物酶标记二抗，Jackson ImmunoResearch Laboratories公司产品。动物呼吸机ALC-V8，上海奥尔科特公司;多道生理信号采集处理系统，成都仪器厂;全自动生化分析仪，日本HITACHI公司;Power Pac Basic电泳仪，美国Bio-Rad公司;MK3酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司。

2 方法

2.1 动物模型复制

大鼠术前12 h禁食不禁水，腹腔注射20%乌拉坦(0.5 m1/100 g)，麻醉后仰卧位固定四肢及头部，记录Ⅱ导心电图。颈部、胸前手术野备皮，切开气管连接动物呼吸机(呼吸频率70次/min，吸呼比1∶2，潮气量9 ml/kg)。自左侧第3～4肋间剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，打开胸腔剪开心包膜，于左心耳与肺动脉圆锥之间找出冠状动脉左前降支，并以5-0号丝线结扎分支起点外约1～2 mm(在丝线与心肌间放一根聚乙烯小管)，此时缺血心肌壁呈现发绀、膨出，同时记录心电图，以标准肢导联Ⅱ导联ST段弓背上抬，T波高耸，显示心肌缺血形成。再灌注模型结扎30 min后松开，使缺血冠脉再灌注，关闭胸腔再灌注120 min，心电图示ST段回落1/2以上，提示造模成功。结扎前心电图不正常或未到观察终点而死亡以及造模不成功者剔除。假手术组在开胸后不结扎冠脉，而仅在相应部位用针空穿1次即可。3-MA干预组于再灌注前10 min尾静脉注射给药(20 mg/kg)。

2.2 动物分组及给药

按随机数字表法将40只大鼠分为假手术组、模型组、3-MA干预组及栝楼薤白半夏方组。各组动物常规饲养，条件相同。栝楼薤白半夏方组灌服中药煎液1 ml/(100 g·d)，其余各组大鼠每日灌服生理盐水1 ml/(100 g·d)，造模前连续给药3周。在实验过程中各组均有死亡，每组随机取8只备检，最终32只大鼠纳入统计。

2.3 指标检测

2.3.1 标本采集 大鼠再灌注2 h后腹主动脉取血，之后迅速剪取心脏，预冷生理盐水冲洗，冰盘上切取部分左冠状动脉供血区的心肌组织，称重后即于液氮中迅速冰冻，置于－80℃保存备用。

2.3.2 血清心肌酶学检测 取血后离心3000 r/15 min分离血清，按试剂盒说明书，利用全自动生化分析仪进行心肌酶指标检测。

2.3.3 Western blot法检测心肌 Beclin-1、LC3II及Bax蛋白水平 取大鼠心肌组织经匀浆离心后，取上清液用BCA法测定蛋白浓度。取各组样品30 μg进行15%SDS-PAGE并电转移至PVDF膜上，室温封闭1 h。以1∶1000用5%BSA-TBST稀释一抗，4℃孵育过夜。然后按1∶10000比例稀释HRP二抗，室温下孵育40 min。ECL反应3～5 min，胶片曝光10 s～5 min显影、定影、洗片。胶片扫描后进行图像分析，以β-actin作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠血清CK、LDH-L表达的影响

表1显示，与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠血清CK、LDH-L含量显著增高，差异有统计学意义(均为P＜0.01);与模型组比较，3-MA干预组及栝楼薤白半夏方组能降低血清CK及LDH-L水平，差异有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)，2组之间比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。

3.2 栝楼薤白半夏汤对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌Beclin-1、LC3II及促凋亡蛋白Bax表达的影响

表1、2及图1显示，与假手术组比较，模型组Beclin-1蛋白表达及LC3II/LC3I比值升高，同时促凋亡蛋白Bax表达也显著上升(均为P＜0.01);与模型组比较，3-MA干预组及栝楼薤白半夏方组能显著下调Beclin-1、LC3II、Bax蛋白表达及LC3II/LC3I比值(P＜0.01或P＜0.05)，且栝楼薤白半夏方组Beclin-1蛋白水平明显低于 3-MA干预组(P＜0.05)。再灌注后，各组间LC3I蛋白表达比较差异无统计学意义。

将模型组Beclin-1、LC3II蛋白表达与Bax表达进行相关性分析，结果显示两者均具有正相关关系(r=0.666，0.575，P＜0.01)。提示随着再灌注后自噬高表达的同时，促凋亡蛋白Bax水平也相应显著升高。

表1 各组大鼠血清心肌酶CK、LDH及心肌Beclin-1、Bax蛋白表达情况(±s)

表1 各组大鼠血清心肌酶CK、LDH及心肌Beclin-1、Bax蛋白表达情况(±s)

注:与假手术组比较:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与3-MA组比较:■P＜0.05，■■P＜0.01

组别 鼠数 CK/U·L LDH/IU·L Beclin-1 Bax假 手 术 组 8 1661.75±534.23 1235.35±602.73 0.15±0.03 0.21±0.03模 型 组 8 3136.75±875.09ΔΔ 2723.31±823.58ΔΔD 0.32±0.09ΔΔ 0.56±0.06ΔΔ3-MA 干 预 组 8 2340.88±766.21* 1747.00±725.11＊＊ 0.24±0.05* 0.33±0.09＊＊栝楼薤白半夏方组 8 2454.75±354.79* 2000.51±612.74* 0.15±0.05＊＊■ 0.30±0.04＊＊

表2 各组大鼠心LC3I、LC3II蛋白表达及LC3II/LC3I比值情况(±s)

表2 各组大鼠心LC3I、LC3II蛋白表达及LC3II/LC3I比值情况(±s)

注:与假手术组比较:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01;与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 鼠数LC3I LC3II LC3II/LC3I假 手 术 组8 0.53±0.01 0.07±0.05 0.13±0.10模 型 组 8 0.39±0.11Δ 0.24±0.08ΔΔ 0.60±0.05ΔΔ3-MA 干 预 组 8 0.45±0.12 0.13±0.11* 0.28±0.18＊＊栝楼薤白半夏方组 8 0.42±0.04* 0.11±0.06* 0.27±0.11＊＊

图1 各组大鼠心肌Beclin-1、LC3II、Bax蛋白表达

4 讨论

心肌坏死是心肌缺血再灌注损伤可能导致的最严重结果，心肌缺血坏死或细胞膜通透性增加，可使心肌内的细胞酶释放入血，因而血清心肌酶可以反映心肌梗死的发生以及病灶的大小，是判断心肌坏死程度的重要指标之一。本实验中采用CK、LDH的释放为观测指标，观察到再灌注后大鼠血清CK、LDH含量显著增加，表明缺血再灌注损伤后心肌细胞受损严重，而栝楼薤白半夏汤对MI/RI心肌具有一定的保护作用，减轻了心肌细胞膜的损伤，降低了心肌酶的释放，从而改善能量代谢障碍，保护心肌细胞。

自噬在维持机体稳态、对抗外界环境变化、应激和炎症反应方面起着重要作用，当自噬出现过表达或应激和炎性反应强烈，自噬的保护作用就会转化成自噬性细胞死亡或凋亡［5］。心肌缺血本质上也是血流供应不足导致的营养物质缺乏，因此自噬可以被缺血诱导，而且再灌注过程会促进自噬体的形成。在心脏再灌注阶段，氧化应激、线粒体损伤及炎症反应等可使自噬过度激活，从而过度降解重要蛋白和细胞器会诱导细胞不可逆死亡［6］。Beclin-1是调节细胞自噬过程的关键基因，Beclin-1的表达水平一定程度上反映了自噬的活性。LC3是自噬标志性蛋白，分为2个亚型，在细胞自噬形成过程中，LC3Ⅰ被剪形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ在细胞自噬泡形成过程中起到重要作用［7］。因此，在应激情况下LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的比值可以反映自噬被激活的程度。本实验研究显示，再灌注后大鼠心肌Beclin-1、LC3Ⅱ蛋白水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高，说明此时心肌自噬被激活且维持过表达水平，栝楼薤白半夏汤具有与自噬抑制剂3-MA作用相当的抑制自噬效应。

MI/RI过程中，细胞凋亡是MI/RI重要的病理环节之一，是心肌缺血及再灌注细胞死亡的一种主要形式［8］。凋亡亦与自噬之间存在密切的内在联系，有研究［9］利用创伤后迟发性心脏损伤模型发现，自噬和凋亡既相互独立又存在相互作用，低水平的自噬具有保护作用，可以抑制凋亡;当自噬调节不当或过度时，可以诱发凋亡或坏死，且相关性分析显示，自噬与凋亡的发生密切相关。以往研究证明［10］，在Bcl-2/bcl-XL低表达、Bax过表达的细胞中，抗凋亡能力受到抑制，可通过Caspase-3依赖的Beclin-1裂解以降低自噬水平;而在抗凋亡Bcl-2的蛋白高表达的细胞中，Bax中止 Bcl-2/bcl-xl和Beclin-1的相互作用以加强自噬，从而进一步解释了本实验的结果。

自噬在缺血再灌注损伤中发挥着重要作用，自噬的变化直接关联着心肌细胞的存亡。本实验结果说明，MI/RI后心肌血清心肌酶水平升高，自噬表达迅速上调，心肌凋亡严重，栝楼薤白半夏汤可以通过抑制自噬过表达，减轻凋亡反应，发挥对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

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Effects of Gualou Xiebai Banxia Decoction on the Myocardial Autophagy and Apoptosis in Rats with Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

TANG Dan-li1，LIU Zhai-hua2，CUI Hai-feng1，ZHOU Yan-hua1，SUI Yu1，ZHANG Hua-min3△
(1．Experimental Research Center of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China; 2．Institute of Basic Theory for Chinese Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China; 3．Institute of Information on Chinese Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing100700，China)

Objective:To study the effects of Gualou Xiebai Banxia decoction(GXBD)on autophagy and antiapoptosis of myocardial ischemia-reperfusion injury(MI/RI)in rats．Methods:40 SD rats were randomly divided into sham-operated group，model group，3-MA and GXBD groups．The model of ischemia reperfusion of the myocardium was reproduced by ligation of left descending artery for 30 min and followed by releasing the ligation for 2 hours in rats．Serum contents of CK，LDH were measured by automatic biochemical analyzer，the protein expression of Beclin-1、LC3II，Bax and the level of LC3 II/LC3I were determined by Western blot．Results:Compared with the sham-operated group，the contents of CK、LDH and the protein expression of Beclin-1，LC3 II，Bax and the level of LC3 II/LC3I were both significantly increased in MI/RI model groups;Compared with the model group，the 3-MA and GXBD groups down-regulated the expression of Beclin-1，LC3II，Bax and LC3 II/LC3I．The level of Beclin-1 in GXBD group were decreased than that in 3-MA group(P!0.05)．Conclusion:Autophagy and apoptosis were induced and activated by MI/RI，GXBD may protect cardiomyocytes of MI/RI rats by inhibiting autophagy and reducing apoptosis．

Myocardial ischemia-reperfusion injury;Autophagy;Apoptosis;Gualou Xiebai Banxia decoction (GXBD)

R285．5

B

1006-3250(2016)02-0177-04

2015-06-17

国家自然科学基金资助项目(81202630)-痰瘀同治法对心肌缺血再灌注损伤中核转录因子-κB与自噬交互作用的调控机制研究;国家自然科学基金资助项目(81373792)-痰瘀同治法对MI/RI中IKK/NF-κB-PI3K/Akt信号转导网络与自噬间交互作用的调控机制研究;中国中医科学院自主选题项目(ZZ2014002)-栝楼薤白半夏汤对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用中自噬及凋亡调控效应的影响

唐丹丽(1979-)，女，山东人，副研究员，医学博士，从事中医药防治心血管疾病的临床与研究。

△通讯作者:张华敏，女，研究员，医学博士，从事中医药防治心血管疾病的临床与研究，E-mail:zhanghm@mail．cintcm．ac．cn。