一种病证结合痰浊阻窍证老年期痴呆大鼠模型的建立*

陈燕清，张俊龙，郭 蕾，秦亚莉，韩 诚

(山西中医学院基础医学院，太原 030024)

一种病证结合痰浊阻窍证老年期痴呆大鼠模型的建立*

陈燕清，张俊龙△，郭 蕾，秦亚莉，韩 诚

(山西中医学院基础医学院，太原 030024)

目的:建立一种病证结合的痰浊阻窍证老年期痴呆大鼠模型。方法:61只大鼠随机分为A空白对照组、B老年性痴呆组、C血管性痴呆组、D痰浊阻窍证组、E病证结合(AD+VD+痰浊阻窍证)组，从Morris水迷宫、血脂、海马神经元超微结构等不同方面，对痰浊阻窍证老年期痴呆大鼠模型的建立进行初步探索。结果:造模成功后，Morris水迷宫实验显示B、C、E组与A组间逃避潜伏期及目标象限停留时间、原平台区穿越次数数据，差异有统计学意义。血脂化验显示，D组及E组的TC、LDL-C升高为其余各组的2倍以上。透射电镜下观察大鼠海马CA1区超微结构，可见E组的神经元细胞超微结构受损最为严重，B组次之，再次为C组与D组。结论:该模型可作为痰浊阻窍证老年期痴呆模型使用，用于老年期痴呆的实验研究。

病证结合;痰浊阻窍证;老年期痴呆

老年期痴呆［1］是指老年人(＞60岁)出现持续时间较长的智力损害，表现为记忆、计算、思维、定向力、情感障碍及人格改变，并出现社会活动能力和自身活动能力的减退，其主要临床类型包括老年性痴呆(AD)和血管性痴呆(VD)［2］。国内研究表明［3］，60岁以上的老年人中按痴呆的患病率为0.75% ～4.69%。中医药治疗老年期痴呆具有肯定的疗效，但目前对于动物模型的药效学和作用机制的探讨，多停留于西医疾病水平，很少结合中医的证候因素进行研究，病证结合的老年期痴呆动物模型较少。本研究通过集VD、AD及痰浊阻窍证于一体的大鼠模型，为建立一种新的病证结合老年期痴呆大鼠模型提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

健康SPF级SD雄性大鼠61只，体质量(300± 20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK(京)2012-0001)。大鼠在相同条件下喂养，室温(22±2)℃，保持自然光照，自由饮水、摄食。适应性喂养1周后，应用Rand函数将大鼠随机分为A组(空白对照组)9只，B组(老年性痴呆组)13只，C组(血管性痴呆组)13只，D组(痰浊阻窍证组)13只，E组(病证结合AD+VD+痰浊阻窍证)13只。

1.2 药品与仪器

D-半乳糖(Amresco公司，批号20120120);水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20100331);戊二醛(成都市新都区木兰镇工业开发区，批号0120213);DigBehv-MG(通用型)Morris水迷宫视频分析系统(上海吉量软件科技有限公司); JEM-1011透射电镜(日本电子公司);高脂饲料购自北京华阜康生物科技有限公司，高脂饲料配方为10%猪油、10%蛋黄粉、1%胆固醇、0.5%丙基硫氧嘧啶，78.5%基础饲料。

2 方法

2.1 造模方法

各组大鼠同时开始处理。A组每日以生理盐水1 ml腹腔注射，连续6周;B组每日D-半乳糖50 mg/kg腹腔注射，连续6周;C组先结扎一侧颈总动脉，1周后结扎另外一侧。A、B、C组均喂饲普通饲料。D组采用高脂饲料喂养，连续6周;E组同C组方式结扎双侧颈总动脉，每日D-半乳糖50 mg/kg腹腔注射，并采用高脂饲料喂养，连续6周。

2.2 行为学测试

6周造模结束后，采用Morris水迷宫测试大鼠的学习记忆能力。在目标象限放置没入水下2 cm的平台，采用视频摄像跟踪技术，同步记录大鼠运动轨迹。前5 d进行定位航行实验检测大鼠的学习能力，选取目标象限及对侧象限将大鼠面向池壁放入水中，系统记录大鼠寻找并爬上平台时所需时间(即逃避潜伏期)，每次训练时间为120 s。如果大鼠在规定时间内未找到平台，须将其引至平台并停留20 s。第6天进行空间搜索实验，撤除平台，在目标象限的对侧象限将大鼠面向池壁放入水中，系统记录大鼠在60 s内目标象限停留时间及原平台区穿越次数，测试大鼠的记忆保持能力。

2.3 电镜样品的制备

6 d水迷宫测试结束后，禁食不禁水12 h，5%水合氯醛(7 ml/kg)腹腔注射麻醉，开腹、腹主动脉采血2 ml用于检测血脂。开胸暴露心脏，灌注针由心尖部插入升主动脉，同时剪开右心耳，用预冷到4℃的生理盐水快速灌注200 ml，至流出液清亮，然后换用预先冷藏的2.5%戊二醛PBS液灌注200 ml，充分固定，冰盘上迅速取脑，剥离右侧海马，在海马CA1区切取大小为1 mm3的组织块，放入预冷的pH 7.0，2.5%的戊二醛固定液3 h，缓冲液中冷藏待检。电镜室采用1%锇酸固定，梯度丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片厚度60～80 nm，醋酸双氧铀-枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察大鼠海马CA1区神经细胞内超微结构，并选取典型部位摄片。

2.4 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示。水迷宫的定位航行实验数据采用重复测量两因素多水平方差分析，其余数据采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 Morris水迷宫检测结果

3.1.1 定位航行实验结果 表1显示，5组大鼠随着训练时间的推移，寻找平台的时间都在缩短。但各组大鼠的学习记忆能力不同，从第2天开始，B、C、E组与A组比较，逃避潜伏期明显延长，差异有统计学意义(P＜0.05)。D组与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 定位航行实验各组大鼠逃避潜伏期的变化(±s)

表1 定位航行实验各组大鼠逃避潜伏期的变化(±s)

注:与A组比较:▲P＜0.05

组 别 鼠数逃避潜伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天A组 9 110.6±12.2 62.2± 3.5 29.7± 7.9 10.0±2.0 6.9±2.3 B组 11 115.2±11.3 79.6± 4.5▲ 43.5± 8.3▲ 32.3±9.3▲ 27.4±6.8▲C组 10 107.3± 8.2 81.9± 9.3▲ 42.7±11.5▲ 33.3±4.6▲ 23.7±7.3▲D组 9 106.8± 3.8 63.3±13.5 31.0± 3.2 12.0±3.5 8.5±5.8 E组 9 113.2± 9.3 82.1± 5.1▲ 65.1± 8.9▲ 39.6±6.8▲ 29.2±7.6▲

3.1.2 空间搜索实验结果 表2显示，B、C、E组与A组比较，目标象限停留时间、原平台区穿越次数差异有统计学意义(P＜0．01)。D组与A组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠目标象限停留时间、原平台区穿越次数(±s)

表2 各组大鼠目标象限停留时间、原平台区穿越次数(±s)

注:与A组比较:▲▲P＜0.01

组别 鼠数 目标象限停留时间(s)原平台区穿越次数A组9 49.18±3.23 7.39±1.36 B组 11 28.69±6.15▲▲ 3.23±1.31▲▲C组 10 26.06±8.19▲▲ 3.56±1.73▲▲D组 9 47.96±3.68 6.96±1.99 E组 9 25.05±5.13▲▲ 3.54±1.65▲▲

3.2 血脂检测结果

表3显示，各组大鼠的TC与LDL-C水平比较，D组与E组比A组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组大鼠血脂检验结果(±s)

表3 各组大鼠血脂检验结果(±s)

注:与A组比较:▲P＜0.05。

组别 鼠数TC TG HDL-C LDL-C A组9 1.27±0.28 0.31±0.11 0.88±0.06 0.25±0.01 B组 11 1.21±0.31 0.35±0.06 0.79±0.12 0.23±0.07 C组 10 1.19±0.15 0.42±0.13 0.82±0.11 0.31±0.08 D组 9 3.39±0.49▲ 0.47±0.02 0.79±0.07 1.61±0.12▲E组 9 3.28±0.36▲ 0.43±0.02 0.77±0.14 1.82±0.21▲

3.3 电镜观察海马CA1区神经元细胞超微结构结果

图1显示，各组大鼠海马CA1区神经元细胞内超微结构如线粒体、轴突、细胞核、溶酶体等变化。

图1 各组海马CA1区神经元细胞超微结构

电镜下可见，A组的细胞器结构正常，线粒体结构清晰;细胞核的核型规整，核膜完好;神经突触结构完整，突触小泡均匀。B组细胞内线粒体空泡变性，线粒体嵴脱落，排列紊乱;细胞核核型不规整，表面凹凸不平，核膜发生断裂;突触小泡减少。C组细胞线粒体结构不清，嵴脱落断裂，高尔基体肿胀，并有自噬现象的次级溶酶体，吞噬物主要为破碎的线粒体;细胞核核型不规整，核膜有断裂现象，突触小泡减少。D组细胞线粒体肿胀变形，嵴排列紊乱;细胞核无明显变化，神经突触相对正常。电镜下观察，本组标本在各造模组中损害最轻。E组海马CA1区神经元细胞线粒体肿胀、膜破裂，出现多量畸形线粒体。次级溶酶体有明显的自噬现象，吞噬物主要为破碎的线粒体。细胞核变形，染色体边集，核膜断裂。突触连接间断，突触小泡明显减少。电镜下观察，本组标本在各造模组中损害最为严重。

4 讨论

从临床可知，VD与AD的症状、病理、神经生物化学等诸多特点经常交叉重叠，难以截然分开［4］，且常见2种痴呆并存［5］。故本次实验设计了结扎双侧颈总动脉造成VD模型，并同时给予D-半乳糖腹腔注射造成AD的复合疾病模型。鉴于之前同时结扎双侧颈总动脉，大鼠脑部短时间内缺血损害严重，脑部供血不能迅速代偿，死亡率高。本次实验参照文献［6］间隔1周结扎两侧的颈总动脉，大鼠存活率较高。采用经典的考察大鼠学习记忆能力的Morris水迷宫进行验证，老年期痴呆疾病模型造模成功。

中医认为，高脂血症乃血中之痰浊，属于“无形之痰”范畴［7］。研究发现［8］，痰浊证患者血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量均明显高于非痰浊证组和正常人组。高脂血症的脂质水平和中医辨证分型有一定的相关性［9］，即高血脂为血中痰浊的客观指标或生化物质基础［10］。现代医学认为，外源性的脂质摄入是血脂升高的重要原因。本次实验采用高脂饲料喂养42 d的方式造成大鼠高脂血症。血脂结果显示，喂饲高脂饲料的痰浊阻窍证组、病证结合组的TC、LDL-C明显升高，但TG、HDL-C无明显变化，与文献报道［11］的高脂饲料可以造成大鼠的高胆固醇血症一致，高胆固醇血症可以看作是中医的痰浊证。透射电镜结果显示，造模各组海马CA1区的神经元细胞都有程度不同的损害，其中尤以造模干预最多的病证结合组最为严重。但是只单纯喂饲高脂饲料的痰浊阻窍证的CA1区神经元细胞也有损害，这些损害积聚到一定程度，也可能成为痴呆症状产生的物质基础，故高脂血症可以看作是痰浊阻窍证。

病证结合的中医动物模型是指在制作模型时，将西医的疾病与中医证候同时加以考虑，不仅能够体现疾病的生理病理变化，而且具备中医证候特征，此类模型在用于中医药的研究时具有独特的优势［12］。本次实验在老年期痴呆动物模型的基础上叠加了中医的痰浊阻窍证，造成病证结合的动物模型，在痴呆疾病中引进中医痰浊证的病因病机，为建立一种病证结合老年期痴呆动物模型进行了有益的探索。

［1］盛树立．老年性痴呆及相关疾病［M］．北京:科学技术文献出版社，2006:4．

［2］晏勇．血管性痴呆的诊断和相关问题［J］．中华老年心脑血管病杂志，2008，10(5):321-323．

［3］李智杰．老年期痴呆［M］．北京:中国医药科技出版社，2010: 4．

［4］Kalaria R．Similarities between Alzheimer's disease and vascular dementia［J］．J Neurol Sci，2002 Nov 15，203-204:29-34．

［5］Zekry D，Hauw JJ Mixed dementia:epidemiology，diagnosis，and treatment［J］．J Am Geriatr Soc，2002，50(8):1431-1438．

［6］黄敬，刘学源，梅元武，等．老化血管性痴呆大鼠的制备［J］．中华神经医学杂志，2008，7(2):143-147．

［7］韩崇伟．健脾化痰治疗高脂血症的理论探讨［J］．山东医药，2006，46(10):78．

［8］孙建芝，牛晓亚，韩丽华，等．痰浊证微观辨证指标的实验研究［J］．河南中医，1996，16(2):21．

［9］屠浩明．高脂血症血脂水平与中医辨证分型的相关性研究［J］．福建中医药，2003，34(6):3．

［10］宋剑南，周瑕菁，周玉萍，等．从高脂血症及动脉粥样硬化探讨痰瘀理论及痰瘀同治机制［J］．医学研究通讯，2001，30 (8):24-25．

［11］姬凤彩，姚刚，李琳琳，等．对大鼠高脂血症模型分型的探讨［J］．新疆医科大学学报，2007，30(11):1297-1298．

［12］赵慧辉，郭书文，王伟．病证结合动物模型判定标准的建立［J］．北京中医药大学学报，2009，32(6):365-367．

Establishment of the Combined Disease and Syndrome Model of Phlegm Blockage in Senile Dementia Rats

CHEN Yan-qing，ZHANG Jun-long△，GUO Lei，QIN Ya-li，HAN Cheng
(Shanxi University of Traditional Chinese medicine，Taiyuan 030024，China)

The syndrome of phlegm obstructing orifices of senile dementia rat model was established by a combination of disease and syndrome．Methods:61 rats were randomly divided into A blank control group，B AD group，C VD group，D phlegm blocking orifices group，E combination of disease and syndrome(AD+VD+syndrome of phlegm obstructing orifices)group，from the behavior of rats，biochemical，morphological aspects preliminary exploration of establishing model，the syndrome of phlegm obstructing orifices of senile dementia rats．Results:After the success of modeling，Morris water maze test showed that B，C，E group and A group had significant difference．Blood tests:D group and E group TC，LDL-C increased above 2 times+the other groups．Observation on ultrastructure of hippocampus CA1 area of rats under transmission electron microscope，neuronal cell ultrastructure was observed in E group the damage was most severe，followed by the B group，C group and D group again．Conclusion:The model may be used as phlegm blocking orifices of senile dementia model，used for experimental study of senile dementia．

Combination of disease and syndrome;Syndrome of phlegm obstructing orifices; Senile dementia

R-332

B

1006-3250(2016)02-0174-03

2015-06-24

国家自然科学基金资助项目(81173165)-老年期痴呆典型证候病证结合判别模式研究;国家自然科学基金资助项目(81202623)-老年性痴呆肾阳虚证与痰浊阻窍证同病异证及方证相应的生物学机制研究;山西省自然科学基金资助项目(2013011051-3)-老年性痴呆模型大鼠同病异证的机制研究

陈燕清(1973-)，女，山西太谷人，副教授，医学博士，从事藏象理论研究。

△通讯作者:张俊龙(1963-)，男，山西吉县人，教授，医学博士，从事中医基础理论，E-mail:jlzhang63@163．com。