肥胖合并动脉粥样硬化大鼠血管内皮依赖性舒张功能以及亲环素A 和p-ERK1/2表达的变化

李敏，黎红华，盛冲霄



肥胖合并动脉粥样硬化大鼠血管内皮依赖性舒张功能以及亲环素A 和p-ERK1/2表达的变化

李敏，黎红华，盛冲霄

摘要

关键词肥胖症；动脉粥样硬化；内皮依赖性松弛因子类；亲环素A

作者单位：430070 湖北省武汉市，南方医科大学武汉临床医学院 广州军区武汉总医院 神经内科

Endothelial-dependent Vasodilatation and Expressions of CyPA, p-ERK1/2 in Experimental Rats With Obesity Combining Atherosclerosis

LI Min, LI Hong-hua, SHENG Chong-xiao.
Wuhan Clinical Institute Affiliated to Southern Medical University, Wuhan (430070), Hubei, China
Corresponding Author: LI Hong-hua, Email: Lihonghua567@aliyun.com

Abstract

Objective: To observe the endothelial-dependent vasodilatation and expressions of cyclophilin A (CyPA), phosphorylated extracellular signal regulated kinase1/2 (p-ERK1/2) in experimental rats with obesity combining atherosclerosis.

Methods: A total of 30 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: Control group, the rats received basic diet followed by intraperitoneal injection of normal saline; Atherosclerosis (AS) group, the rats received basic diet for 8 weeks followed by high cholesterol diet with intraperitoneal injection of a single dose vitamin D3 600,000 IU/kg; Obesity+AS group, the rats received high cholesterol diet for 8 weeks (which made their body weights at 20% higher than the other 2 groups) followed by intraperitoneal injection of a single dose vitamin D3 600,000 IU/kg. n=10 in each group. 16 weeks later, the endothelial-dependent vasodilatation was examined in all rats, expressions of CyPA and p-ERK1/2 in arterial wall were detected by HE staining and immunohistochemistry.

Results: Compared with Control group, both AS group and Obesity+AS group had reduced endothelial-dependentvasodilatation (72.49 ± 3.27) % and (42.28 ± 2.62) % vs (96.63 ± 3.85) %, such reduction was even more in Obesity+AS group (42.28 ± 2.62) % vs (72.49 ± 3.27) %, all P<0.05. HE staining displayed that in Control group, AS group and Obesity+AS group had normal vessel structure, the endothelial cell damage, vessel smooth muscle cell proliferation, atherosclerosis and calcification plaques at different degrees; immunohistochemistry indicated that the expressions of CyPA and p-ERK1/2 in endothelial and smooth muscle cells were increased accordingly in above 3 groups, all P<0.05 between any 2 groups.

Conclusion: The rats with obesity and AS had decreased endothelial-dependent vasodilatation, severe atherosclerosis and calcification plaques, increased expressions of CyPA and p-ERK1/2, which speculated that obesity might be an independent risk factor for atherosclerosis.

Key words Obesity; Atherosclerosis; Endothelium-dependent diastolic function; Cyclophilin A

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:77.)

目前，随着人们生活饮食习惯改变，肥胖症的发生率逐年升高，已经成为威胁人类健康主要危险因素之一。肥胖症是体内脂肪大量堆积并伴有代谢紊乱的综合征，患者多伴有血糖、血脂异常、瘦素抵抗和胰岛素抵抗，与动脉粥样硬化（动脉硬化）形成密切相关[1]。动脉硬化以内皮功能障碍为起始事件的血管壁慢性炎性过程。近年来，亲环素A （cyclophilin A， CyPA）与氧化应激、动脉硬化病变的关系成为研究热点[2]。CyPA是一种重要的氧化应激诱导分泌的生长因子，在机体氧化应激状态下由血管内皮细胞和血管平滑肌细胞（VSMC）分泌[3]。分泌至细胞外的CyPA介导活性氧（ROS）介质激活细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal regulated kinase, ERK1/2），磷酸化ERK1/2（p- ERK1/2）将信号从细胞膜表面受体转导至胞核，诱导核因子κB （NF-κB）活化 ,炎性细胞增殖、迁移,促炎性反应；同时促进血管平滑肌细胞DNA合成、增殖，抑制凋亡[4]。但是CyPA是否参与肥胖导致的动脉硬化发生发展，目前尚少见报道。本文旨在研究肥胖基础上联合高脂饮食复制大鼠动脉硬化模型，观察内皮依赖性血管舒张功能改变，以及CyPA、p-ERK1/2在血管内皮和平滑肌细胞内的表达，揭示肥胖促进动脉硬化的机制，为动脉粥样硬化的预防及治疗提供新依据。

1　材料与方法

实验动物：SPF级健康雄性Wistar大鼠30只，体重180～200 g，动物合格证号：420006000074S69，湖北省实验动物研究中心提供。分笼饲养在华中科技大学实验动物中心SPF环境中，室内温度（22±1）℃，湿度（60±10）%，自由进食水，12 h明暗交替。

主要实验药剂：维生素D3注射液（上海通用药业），胆固醇、胆酸钠（武汉胜天宇生物科技有限公司），兔抗CyPA抗体、兔抗p-ERK1/2抗体（北京索莱宝科技有限公司）。基础饲料由华中科技大学实验动物中心提供，高脂饲料（81.3%普通饲料、5%蔗糖、10%猪油、3%胆固醇、0.5%胆酸盐、0.2%丙基硫氧嘧啶）由湖北省万千佳兴生物科技有限公司加工。

主要仪器：BL-420S生物机能实验系统、HV-4离体组织器官恒温灌流系统、JH-2型张力换能器，由成都泰盟公司生产。YB-6型生物组织包埋机，RM2016型Leica石蜡切片机，OLYMPUS BX51照相显微镜等。

方法：30只大鼠随机分为3组，对照组10只，动脉硬化组10只，肥胖+动脉硬化组10只。动脉硬化组先给予基础饲料8周后改为高脂饲料喂养，并在高脂饲料喂养第2天给予一次性腹腔注射维生素D3注射液60万IU/kg。对照组给予基础饲料，腹腔注射等量生理盐水；肥胖+动脉硬化组给予高脂饲料（第8周测体重高于另外两组20%以上，肥胖模型[5]），8周后给予一次性腹腔注射维生素D3注射液60万IU/kg。造模16周后处死大鼠，取材。

取材：过量水合氯醛麻醉处死大鼠，剔除周围组织，快速分离腹主动脉。（1） 离体血管环内皮依赖性舒张功能测定：每条腹主动脉截取约4 mm长血管环连接到JH-2型张力换能器，下方以钢钩固定于槽底，置于含Krebs液的HV-4离体恒温组织器官灌流系统，给予2 g张力负荷，通入95% O2和5% CO2的混合气体，在37℃水浴中平衡1 h，每15 min换Krebs液1次。血管环张力平衡后向浴槽中加入终浓度为1×10-6mol/L去甲肾上腺素收缩血管环，待其张力达平顶后依次加入不同浓度（1×10-9～1×10-4mol/L）的乙酰胆碱，记录每一浓度下血管环的张力，取各组的平均张力，各浓度的内皮依赖性舒张反应=[（最大张力-各浓度点的张力）/（最大张力-基础值）]×100%，绘制浓度反应曲线。（2）苏木素—伊红（HE）染色：新鲜腹主动脉以4%多聚甲醛固定48 h后，行石蜡包埋，切片（横切，片厚2 μm），按照HE染色步骤染色后置于400倍光镜下观察并摄片。（3）免疫组化SP法染色与数据采集： 石蜡切片按照免疫组化SP法步骤进行染色。以胞浆胞膜出现棕黄色染色为CyPA染色阳性，以胞浆胞核出现棕黄色染色为p-ERK1/2染色阳性。每张切片随机抽取3个不同的400倍视野，采用Image-Pro Plus 6.0软件对免疫组化图片进行分析，测定其平均光密度（平均光密度=累积光密度/测量区域面积）。

统计学分析：统计分析采用SPSS21.0软件。计量资料服从正态分布采用±s表示，组间比较采用t检验，不服从正态分布采用中位数（四分位间距）描述，组间比较采用秩和检验；P<0.05为差异有统计学意义。腹主动脉HE染色结果存在显著差异。对照组大鼠腹主动脉内皮光滑完整，内皮细胞排列整齐，无增生、凋亡，未见炎性细胞浸润；平滑肌细胞排列整齐，无平滑肌细胞增生，未见弹性纤维连续性中断（图1A）。动脉硬化组大鼠动脉内皮细胞凋亡，血管内皮完整性损伤；平滑肌细胞出现增生、细胞核排列紊乱，内皮下可见炎性细胞浸润，细胞外基质增大，弹性纤维连续性中断，粥样斑块形成（图1B）。肥胖+动脉硬化组大鼠血管内皮损伤脱落，弹性纤维断裂，血管中层钙化斑块形成（图1C）。

表1　三组大鼠腹主动脉环在乙酰胆碱浓度梯度下内皮依赖性舒张功能比较(n=10，%，±s）

表1　三组大鼠腹主动脉环在乙酰胆碱浓度梯度下内皮依赖性舒张功能比较(n=10，%，±s）

注： 表示各浓度下组间两两比较P<0.05

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图1　三组大鼠腹主动脉切片苏木素—伊红染色结果（×400）

2　结果

三组大鼠腹主动脉环对乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张功能比较： 30只大鼠腹主动脉环对浓度梯度（1×10-9～1×10-4）mol/L下的乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张功能均有不同反应。对照组内皮依赖性舒张功能良好，最大舒张功能达（96.63±3.85）%， 动脉硬化组和肥胖+动脉硬化组内皮依赖性舒张功能下降，最大舒张功能分别是（72.49±3.27）%、（42.28±2.62）%，均明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），肥胖+动脉硬化组又显著低于动脉硬化组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

各组大鼠血管HE染色结果：光镜下各组大鼠

三组大鼠动脉CyPA、p-ERK1/2免疫组化染色及平均光密度比较：免疫组化染色后光镜下观察三组大鼠腹主动脉血管壁内CyPA、p-ERK1/2均有不同程度的表达。CyPA主要表达在血管内皮细胞及血管平滑肌细胞胞浆，p-ERK1/2主要在血管内皮细胞和平滑肌细胞胞浆及胞核内显著表达。动脉硬化组、肥胖+动脉硬化组大鼠血管壁内CyPA、p-ERK1/2的表达明显高于对照组，而肥胖+动脉硬化组大鼠腹主动脉血管壁内上述指标的表达又显著高于动脉硬化组（见图2A、2B、2C及图3A、3B、3C）。平均光密度测定结果提示，CyPA、p-ERK1/2的表达在对照组、动脉硬化组和肥胖+动脉硬化组成显著递增趋势，三组之间两两比较差异均有统计学意义（P 均<0.05，见图4）。

图2　三组大鼠腹主动脉亲环素A免疫组化染色结果（×400）

图3　三组大鼠腹主动脉磷酸化细胞外信号调节激酶1/2免疫组化染色结果（×400）

图4　三组大鼠腹主动脉亲环素A和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2免疫组化平均光密度测定（n=10）

3　讨论

肥胖症是指体内脂肪堆积过多并伴有代谢紊乱的综合征，是一种慢性炎症状态。脂肪组织是最大的内分泌器官，血管膜周脂肪组织分泌脂肪因子等加速血管内皮炎性反应，肥胖引起的脂代谢紊乱、胰岛素抵抗亦可诱发血管内皮功能障碍[6，7]。大量研究证实，过度的脂肪沉积尤其内脏脂肪过度聚集诱发机体氧化与抗氧化能力失衡，导致活性氧在体内大量堆积，在内皮损伤下诱导血管膜周脂肪组织分泌脂肪因子、炎性因子等引起血管组织损伤，促进动脉粥样硬化发生发展[8，9]。CyPA属于亲环素家族，是免疫抑制剂环孢素A（cyclosporine，CsA）的胞内结合蛋白，目前研究认为其还具有前炎症因子及促动脉硬化作用，贯穿动脉硬化进展全程[10]。CyPA作为氧化应激诱导分泌的生长因子，在氧化应激下受活性氧诱导由血管内皮细胞和平滑肌细胞产生并通过囊泡运输方式分泌到细胞外，而分泌出的CyPA反过来通过细胞外信号途径，促进细胞产生更多ROS；两者相互促进相互诱导，放大机体氧化应激状态[11]。增加的CyPA主要在胞外发挥前炎性因子功能，参与对炎性信号转导通路的激活，促进炎性反应、内皮细胞的凋亡及平滑肌细胞增殖；同时通过对血管壁清道夫受体调节，促进低密度脂蛋白胆固醇的摄取等均参与动脉硬化的进展。研究表明，细胞外CyPA可激活ERK1/2以其蛋白磷酸化形式存在（p-ERK1/2），ERK1/2的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至胞核的关键[12]。在内皮细胞诱导NF-κB活化、DNA合成、炎性细胞增殖迁移，促进炎性反应；同时亦可促进平滑肌细胞DNA合成、细胞增殖，抑制细胞凋亡。

根据文献[13]，本实验通过运用高脂饲料联合维生素D3注射液复制肥胖症、动脉硬化大鼠模型。维生素D3注射液具有促进小肠对钙的吸收，短期大量给予实验动物摄入维生素D3人为引起高钙血症，联合高脂饲料喂养刺激大鼠机体代谢紊乱、氧化应激水平升高，诱导大鼠全身性血管钙化。通过比较各组血管内皮舒张功能、血管壁动脉硬化斑块形态学改变，以及血管壁CyPA、p-ERK1/2表达水平差异，明确了CyPA、p-ERK1/2与动脉硬化严重程度的关系。结果显示动脉硬化组大鼠血管内皮依赖性舒张功能较对照组大鼠明显下降，血管内皮细胞凋亡、完整性损伤；平滑肌细胞出现增生、细胞核排列紊乱，内皮下可见炎性细胞浸润，细胞外基质增大，弹性纤维连续性中断，粥样斑块形成；血管壁CyPA、p-ERK1/2表达明显增高。推测高脂诱导氧化应激状态促进CyPA分泌，胞外CyPA磷酸化ERK1/2并向核内转导，诱导炎性反应、DNA合成、平滑肌细胞增殖，促进动脉硬化发生发展[14]。

肥胖加剧动脉硬化的发生是毋容置疑的，但是CyPA是否参与这一机制目前少见报道。本实验在肥胖基础上联合高脂饲料喂养大鼠，通过与对照组、动脉硬化组对比结果显示，肥胖+动脉硬化组大鼠内皮依赖性舒张功能下降最显著，血管内皮脱落，弹性纤维断裂，血管中层钙化斑形成，血管壁CyPA、p-ERK1/2表达较其余组均明显增加[15，16]。推测CyPA、p-ERK1/2信号机制参与肥胖症加重血管动脉硬化进展，可能是动脉硬化病变的独立危险因素。

综上所述，高脂饮食诱导机体氧化应激水平升高，血管动脉硬化斑块形成，CyPA、p-ERK1/2在动脉硬化斑块中显著表达。在氧化应激状态下，分泌至胞外CyPA通过激活p-ERK1/2促进动脉硬化进展，且与动脉硬化严重程度密切相关。由此我们认为，CyPA可能是动脉硬化的始动因子，参与动脉硬化的发生发展。肥胖加重动脉硬化病变程度，CyPA、p-ERK1/2信号机制参与肥胖症加重血管动脉硬化进展，肥胖症可能是动脉硬化病变的独立危险因素。

参考文献

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（编辑：漆利萍）

基础与实验研究

(收稿日期：2015-07-18)

中图分类号：R543

文献标识码：A

文章编号：1000-3614（2016）01-0077-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.01.017

作者简介：李敏 硕士研究生 研究方向为动脉粥样硬化在心脑血管疾病发生发展的机制 Email:1437681545@qq.com 通讯作者：黎红华Email:Lihonghua567@aliyun.com

基金项目：湖北省自然科学基金（2013CFB428）

目的：观察肥胖合并动脉粥样硬化（动脉硬化）大鼠血管内皮功能的改变以及亲环素A（CyPA）和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（p-ERK1/2）的表达变化。

方法：雄性Wistar大鼠30只随机分为3组，对照组（10只）、动脉硬化组（10只），肥胖+动脉硬化组（10只）。对照组给予基础饲料+腹腔注射等量生理盐水；动脉硬化组基础饲料8周后给予高脂饲料+维生素D3注射液60万IU/kg一次性腹腔注射；肥胖+动脉硬化组给予高脂饲料（肥胖症模型，高脂喂养8周体重大于其余组大鼠20%）+维生素D3注射液60万IU/kg一次性腹腔注射。16周后测定血管内皮依赖性舒张功能；苏木素—伊红（HE）染色、免疫组化检测动脉血管壁CyPA及p-ERK1/2的表达。

结果：与对照组相比，动脉硬化组、肥胖+动脉硬化组血管内皮依赖性舒张功能下降[（72.49±3.27）% vs （96.63±3.85）%]，[（42.28±2.62）% vs （96.63±3.85）%]，且肥胖+动脉硬化组下降更明显[（42.28±2.62）% vs （72.49±3.27）%]，三组比较差异均有统计学意义（P均<0.05）。HE染色显示，三组大鼠血管壁分别为正常结构，内皮细胞破坏、平滑肌细胞增生和粥样钙化斑块形成等不同程度病变特征。免疫组化提示三组大鼠血管内皮及平滑肌细胞内CyPA及p-ERK1/2表达逐渐升高，组间两两比较差异均有统计学意义（P均<0.05）。

结论：肥胖+动脉硬化组大鼠血管内皮依赖性舒张功能显著下降，动脉硬化钙化斑块严重，CyPA及p-ERK1/2表达显著增加。推测CyPA、p-ERK1/2信号机制参与肥胖症加重血管动脉硬化进展，肥胖可能是动脉硬化病变的独立危险因素。