“计数方法”解读和实例分析

江苏 吴海峰

“计数方法”解读和实例分析

江苏 吴海峰

本文旨在分析和比较高中生物学中计数的五种方法，并结合实例具体描述，剖析五种“计数方法”的差异，从而突破其难点，提升解题能力。

一、基本知识解读

研究对象植物或活动范围小的动物活动范围大的动物微生物计数方法样方法标志重捕法直接计数法间接计数法（稀释平板计数法）调查程序确定调查对象↓选取样方五点取样法等距取样法↓计算种群密度、计数取平均值重捕、计数确定调查对象↓捕获并标记数量为N1↓捕获数N2标记数N0↓计算种群密度NN =（利用血球计数板）镜检计数室↓加样品↓计数密度：每个小方格细胞数× 400×104个/mL 1 NN 20待测样品做一系列稀释↓稀释菌液接种到培养皿中↓均匀分布↓培养↓统计菌落数目（接种计数结果平均值/接种体积）×稀释倍数举例植物、昆虫卵、作物植株上的蚜虫、跳蝻等活动能力强、活动范围大的动物个体较大的细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞一般多用于筛选菌株注意事项①随机取样②样方大小适中③样方数量不宜太少④宜选用双子叶植物①调查时没有迁入和迁出、出生和死亡②标志物不能过于醒目，不能影响标志对象正常的生命活动①取样之前，要将试管轻轻振荡几下。②加入成倍的无菌水稀释n倍。③对每个样品可计数三次，再取其平均值。④血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷①每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理。②倾注平板时的培养基温度。③移液管需要经过灭菌。④取少量菌液（不超过0.1 mL）

二、具体实例分析

1.样方法分析

计数原则：同种生物个体无论大小都要计数，若有正好在边界线上的，应遵循“计上不计下，计左不计右”的原则，即只计数相邻两边及顶角上的个体。

取样原则及方法：随机取样；样方大小适中：乔木100 m2、灌木16 m2、草本1 m2；样方数量不宜太少；一般选易辨别的双子叶植物（叶脉一般呈网状）；常用五点取样法（如图1）和等距取样法（如图2）。

图1

图2

【例1】（2016·全国卷Ⅱ）如果采用样方法调查某地区（甲地）蒲公英的种群密度，下列做法中正确的是 （ ）

A.计数甲地内蒲公英的总数，再除以甲地面积，作为甲地蒲公英的种群密度

B.计数所有样方内蒲公英总数，除以甲地面积，作为甲地蒲公英的种群密度

C.计算出每个样方中蒲公英的密度，求出所有样方蒲公英密度的平均值，作为甲地蒲公英的种群密度

D.求出所有样方蒲公英的总数，除以所有样方的面积之和，再乘以甲地面积，作为甲地蒲公英的种群密度

【解析】样方法是在被调查种群分布的范围内，随机选取若干个样方，通过计数每个样方内的个体数，求得每个样方内的种群密度，以所有样方内种群密度的平均值作为该种群的种群密度估计值。综上所述，A、B、D三项均错误，C项正确。

【答案】C

2.标志重捕法分析

因为动物被捕获并标记一次后难以被再次捕获，则利用标志重捕法计算出的种群密度会比实际密度偏大。

【例2】（2007·江苏·节选）某研究机构对我国北方草原一种主要害鼠——布氏田鼠进行了调查。调查样方总面积为2 hm2（1 hm2=10 000 m2），随机布设100个鼠笼，放置l夜后，统计所捕获的鼠数量、性别等，进行标记后放归；3日后进行重捕与调查。所得到的调查数据如下表。

___________________捕获数/只标记数/只_雌性个体___ _数___雄_________性个体数_初捕___________________________________ 3__________________ 2 ___________________321418 _重捕_____________________________________________________ 3641818

（1）该草地布氏田鼠的平均种群密度为________只／hm2。事实上田鼠在被捕捉过一次后更难捕捉，上述计算所得的平均种群密度与实际种群密度相比可能会偏________。

（3）在上述调查的同时，还对样方中布氏田鼠的洞口数进行了调查（假设样方中只有这一种鼠），平均每100 m2有3.6个洞口，洞口数与田鼠数的比例关系为________。

【解析】（1）根据公式N=Mn/m，计算出2 hm2的种群总数为288只，种群平均密度是144只/hm2；由于田鼠在被捕捉过一次后更难捕捉，第一次捕捉到的个体被标记后，导致第二次捕捉的个体中被标记的个体数减少，在公式N=Mn/m中由于分母m的值减少，使得N值比实际情况偏高。（2）田鼠种群的性别比例为（14+18）/（18+18）=8∶9。（3）100 m2中田鼠的数量为1.44只，洞口数/田鼠=3.6/1.44≈2.5∶1。

【答案】（1）144 高 （2）8／9（或32／36） （3）2.5∶1

3.直接计数法分析

利用血球计数板可在显微镜下对微生物细胞进行直接计数。计算的数学模型为N=（m×n）×103/（1×1×0.1），模型中各参数的意义：N为1 mL溶液中酵母菌的数量；m为小方格总数；n为每个小方格中酵母菌的平均数；103为1 mL=103mm3；1×1×0.1为计数板上溶液的体积（1 mm为计数板每边总长，0.1 mm为溶液厚度）。

【例3】（改编题）为探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化，某研究性学习小组按下表完成了有关实验。

试管编号培养液/mL无菌水/mL酵母菌母液/mL _温度（℃___）____________________________________ A_____________________________10____________________________________-0.128 ____________________________________ B_____________________________________ 1_________________________________________ 0 -0.15 ___C_______________________________________________________ -100.128

（1）此实验组设计的变量是_______，请写出该小组探究的课题名称： _______。

（2）实验中对酵母菌计数可采用_______法，在吸取培养液前应振荡试管，原因是___________________。

（3）现将1 mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液。

①为什么在接种、培养、稀释和计数的整个实验过程中，要遵守无菌操作规范？

②现观察到上图中该计数室所示a、b、c、d、e 5个中格80个小格内共有酵母菌50个，则上述1 mL酵母菌样品中约有菌体_______个。

【解析】（1）通过对表格中记录的情况进行对比，试管A和B研究的是温度对酵母菌生长的影响，试管A和C研究的是营养物质对酵母菌生长的影响，因此该小组探究的课题名称是探究温度、营养物质对酵母菌生长的影响。（2）实验中对酵母菌计数可采用抽样检测法，在吸取培养液进行计数前应振荡试管，目的是使酵母菌在培养液中分布均匀。（3）①无菌操作就是为了排除杂菌对实验的干扰；②根据题意可知，80个小室内共有酵母菌50个，则整个计数室酵母菌数量=50÷80×400=250个，并且酵母菌样品稀释了100，因此上述1 mL酵母菌样品中约有菌体=250÷（0.1 mm3× 10-3）×100=2.5×108个。

【答案】（1）营养、温度 探究温度、营养物质对酵母菌生长的影响 （2）抽样检测 使酵母菌在培养液中分布均匀 （3）①排除杂菌对实验的干扰 ②2.5×108

4.稀释涂布平板法分析

稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。

【例4】（2014·全国卷Ⅱ·节选）为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：

（1）该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是___________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为____________。

（2）该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过_________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是_________。

（3）示意图A和B中，_________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。

【解析】（1）为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物学实验一般会设置空白对照：随机取若干灭菌后的空白平板培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成；利用平板菌落计数法的计算公式估算水样中的活菌数=（接种计数结果平均值/接种体积）×稀释倍数=（38/0.1 mL）×100=3.8× 107个/L。（2）接种时接种环需要灼烧灭菌；在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是通过划线次数的增加，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。（3）根据示意图A和B中生长出的菌落形态，判定B图为稀释涂布平板法接种培养的结果（菌落分布相对均匀）。

【答案】（1）检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×107（2）灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落（3）B

5.综合分析

【例5】（2016·江苏卷）定量分析是科学研究的重要方法。下列能用血细胞计数板直接计数的是 （ ）

A. 海拉细胞悬液

B. 浓缩培养的噬菌体

C. 自来水中大肠杆菌

D. 蛙卵

【解析】海拉细胞悬液是癌细胞培养液，能用于血细胞计数板直接计数，A正确；噬菌体是病毒，在光学显微镜下不能观察到，B错误；自来水中大肠杆菌数量太少，不能用血细胞计数板直接计数，C错误；蛙卵相互聚集在一起，不能用血细胞计数板直接计数，D错误。

【答案】A

三、总结

以上结合实例探讨了五种“计数方法”的差异和应用，分析“计数方法”的原理和基本过程，来建立数学模型，并进一步提醒注意点，在实际解题中可有利于理清思路迅速答题。

（作者单位：江苏省滨海县八滩中学）