七氟烷预处理对缺血性脑损伤小鼠神经保护作用及与TREK-1通道的关系

袁建清，李志刚，黄樱，王祥云，汪玲红，廖春英

(赣南医学院第一附属医院，江西赣州341000)



七氟烷预处理对缺血性脑损伤小鼠神经保护作用及与TREK-1通道的关系

袁建清，李志刚，黄樱，王祥云，汪玲红，廖春英

(赣南医学院第一附属医院，江西赣州341000)

目的 观察七氟烷预处理对缺血性脑损伤小鼠的神经保护作用，并探讨TREK-1通道与其保护作用的关系。方法 将野生型小鼠随机分为实验1组、对照1组和假手术1组，TREK-1基因敲除型小鼠随机分为实验2组、对照2组和假手术2组，各12只。实验组吸入最小肺泡浓度七氟烷，对照组和假手术组吸入100%空气，均30 min/次，1次/d，连续处理4 d。实验组、对照组采用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型，假手术组仅分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉。用双盲法对神经功能缺损程度进行评分；将小鼠处死取脑组织，用TTC染色法测定脑梗死面积；用免疫荧光法检测脑组织中TREK-1表达；用TUNEL法检测脑组织细胞凋亡。结果 野生型小鼠脑片可见TREK-1大量、广泛地表达于其海马、皮层、脑室旁，而TREK-1基因敲除型小鼠脑片未见明显TREK-1表达。造模后24 h，实验1组神经功能缺损程度评分、脑梗死面积、脑组织凋亡细胞百分比低于对照1组、实验2组(P均<0.05)，实验2组以上指标与对照2组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 七氟烷预处理对缺血性脑损伤小鼠有神经保护作用，TREK-1通道参与该作用过程。

缺血性脑损伤；TREK-1通道；七氟烷；小鼠

七氟烷是一种临床常用的挥发性麻醉药。近期有研究表明，七氟烷预处理在小鼠脑缺血中具有神经保护作用，但其作用机制目前尚未完全明确[1]。TREK-1通道是一种新型的双孔钾离子通道亚型，可被机械牵张、多聚不饱和脂肪酸和一些挥发性麻醉药如氟烷、七氟烷、乙醚等激活。TREK-1通道开放后，介导线性I-V关系的背景K电流和低的膜电位，有助于调控水及离子动态平衡、清除兴奋性毒性物质及氧自由基，发挥神经保护作用[2]。2016年1月笔者通过七氟烷预处理TREK-1基因敲除型和野生型小鼠，观察七氟烷预处理对小鼠缺血性脑损伤的神经保护作用，并探讨TREK-1通道与该保护作用的关系。

1 材料与方法

1.1 动物、材料及仪器 健康雄性8周龄野生型和TREK-1基因敲除型C57 BL/6J小鼠各36只，体质量21～29 g，由赣南医学院动物实验中心提供。七氟烷(美国Baxter公司)，氯化三苯基四氮唑(TTC)、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(美国Sigma公司)，兔抗TREK-1(以色列Alomone Labs公司)，TUNEL试剂盒(美国Milipore公司)，花青素(Cy3)标记的驴抗兔IgG、普通小牛血清、普通羊血清和普通驴血清(美国Jackson ImmunoResearch公司)。CM1900型恒冷切片机(德国Leica公司)，FV500型激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 动物分组及预处理 将野生型小鼠随机分为实验1组、对照1组和假手术1组各12只，TREK-1基因敲除型小鼠随机分为实验2组、对照2组和假手术2组各12只。实验组行七氟烷预处理，将小鼠放入麻醉呼吸箱(Drager公司)中，保持其清醒呼吸状态，吸入最小肺泡浓度七氟烷(2.4%七氟烷/空气)；对照组和假手术组吸入100%空气。均30 min/次，1次/d，连续处理4 d。预处理结束后24 h，进行局灶性脑缺血再灌注(MCAO)模型制备。预处理期间监测各组生理指标(pH、PaCO2、PaO2)，维持肛温(37±0.5)℃。

1.3 MCAO模型制备 应用线栓法建立MCAO模型[3]。各组均用6%水合氯醛麻醉(300 mg/kg)，术中维持动物直肠温度(36.6±0.5)℃。分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉。实验组和对照组小鼠于颈总动脉近颈内动脉、颈外动脉分叉处剪一小口，将一直径0.3 mm、前端5 mm处涂硅胶的尼龙鱼线插入颈内动脉，距颈总动脉分叉处1.8～2.0 cm，1 h后全部拔出丝线进行再灌注，假手术组除不插线栓外余步骤同上。术后各组于20 ℃的空调环境下单笼饲养，自由进水、进食。

1.4 各组神经功能缺损程度评分 造模后24 h，通过双盲法进行神经功能缺损程度评分，评分标准[4]：0分，无神经功能缺损；1分，不能完全伸直右侧前爪；2分，向右侧转圈；3分，向右侧倾倒；4分，无自动活动伴有意识障碍；5分，死亡。

1.5 小鼠脑梗死面积测定 采用TTC染色法。造模后24 h，各组随机取6只小鼠，断头取脑，自视交叉前4 mm开始连续冠状面冰冻切片(2 mm厚)。共取6片切片，置于2% TTC中染色，37 ℃避光孵育20 min，存活组织深红，坏死组织呈白色，数码相机(DSC-T300，SONY)拍照，输入计算机，用Image Tool图像处理软件进行不显色部分面积分析，并计算梗死面积，梗死面积=(∑缺血对侧面积×2 mm-∑缺血同侧未梗死面积×2 mm)/(∑对侧面积×2 mm)×100%[5,6]。

1.6 小鼠脑组织中TREK-1表达检测 采用免疫荧光法。造模后3 d，各组各取剩余6只小鼠快速断头取脑，将脑组织置于-80 ℃冷冻保存。-20 ℃恒冷切片机自视交叉处开始，行10 μm厚连续冠状切片。冰冻切片置4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中(4 ℃)固定15 min，PBS振荡清洗3次，每次5 min，滴加3%普通驴血清封闭液封闭2 h，弃血清，滴加兔抗TREK-1(1∶200)，对照组不加一抗，4 ℃孵育过夜；PBS振荡清洗3次，每次5 min，滴加驴抗兔Cy3(1∶200)，室温避光孵育1 h，流水冲洗40 min，50%甘油封片。激光扫描共聚焦显微镜下观察，激发/发射波长为550/565 nm的CY3呈红色荧光，表示TREK-1蛋白阳性。

1.7 小鼠脑组织细胞凋亡检测 采用TUNEL法检测脑组织细胞凋亡。TUNEL染色严格按照TUNEL试剂盒说明书进行操作，加DAPI复染细胞核。Olympus BX51荧光显微镜下观察细胞凋亡情况，TUNEL阳性细胞即为凋亡细胞。每张片子随机取5个视野，同一曝光条件下照相，取平均值。

2 结果

2.1 各组造模前后神经功能缺损程度评分比较 造模前各组小鼠神经功能缺损程度评分为0分。造模后24 h，实验1组、对照1组、假手术1组神经功能缺损程度评分分别为(1.5±0.5)、(3.5±0.7)、0分，实验2组、对照2组、假手术2组分别为(3.0±0.7)、(3.5±0.8)、0分；实验1组评分低于对照1组、实验2组(P均<0.05)，实验2组评分与对照2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组脑梗死面积比较 造模后24 h，实验1组、对照1组、假手术1组脑梗死面积分别为(16.58±5.88)%、(31.98±10.14)%、0，实验2组、对照2组、假手术2组分别为(25.12±8.91)%、(32.30±10.24)%、0；实验1组脑梗死面积少于对照1组、实验2组(P均<0.05)，实验2组脑梗死面积与对照2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组脑组织中TREK-1表达比较 野生型小鼠脑片可见TREK-1大量、广泛地表达于其海马、皮层、脑室旁，而TREK-1基因敲除小鼠脑片未见明显TREK-1表达。

2.4 各组脑组织细胞凋亡比较 造模后3 d，假手术1组、实验1组、对照1组凋亡细胞百分比分别为(1.27±0.25)%、(9.90±1.68)%、(31.75±2.90)%，假手术2组、实验2组、对照2组分别为(1.40±0.28)%、(30.22±3.37)%、(33.27±3.02)%；实验1组TUNEL阳性细胞百分比低于对照1组、实验2组(P均<0.05)，实验2组TUNEL阳性细胞百分比与对照2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

缺血性脑损伤是一种致死率、致残率极高的多发病、常见病，且易再发和复发，严重危害人类身心健康，并带来巨大的经济负担。探讨治疗缺血性脑损伤的有效措施和药物，是近年来医学研究的一大热点[7]。七氟烷是临床上常用的一种挥发性麻醉药，可增加脑血流量，降低脑的氧代谢率[8]。近期有研究表明，吸入性麻醉药七氟烷在脑缺血中具有神经保护作用[9～11]。但其作用的具体机制尚不清楚，可能对脑血流量、脑代谢、炎症因子及其相关信号传导产生一定影响[12]。有研究认为，七氟烷可减少核因子κB入核，降低其转录调控的炎症因子如环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1(IL-1)、IL-6等来抑制炎症反应[13]；激活KATP通道，抑制缺血期神经元的钙离子和兴奋性氨基酸浓度的升高[12]；抑制脑缺血后的细胞凋亡[1,14]，从而发挥神经保护作用。国外通过细胞培养离体研究表明，双孔钾通道TREK-1参与了七氟烷预处理在脑缺血中的神经保护作用。TREK-1通道是一种新型的双孔钾离子通道亚型，可被机械牵张、多聚不饱和脂肪酸、溶血磷脂和一些挥发性麻醉药如氟烷、七氟烷、乙醚、氙气等激活[15]。TREK-1广泛表达于大鼠海马、皮层，其活性可影响脑缺血时星形胶质细胞的增殖活化以及平衡缓冲功能[16,17]。TREK-1通道开放后，表达具有线性I-V关系的背景钾电流，在细胞膜静息电位的形成和膜电位的复极化中起重要作用。其能稳定膜电位，调节细胞的兴奋性，使细胞膜超极化，减少钙离子内流，降低谷氨酸的转运和兴奋性细胞毒性[2,15]。

本研究通过七氟烷预处理TREK-1基因敲除型和野生型小鼠后，建立MCAO，结果发现，七氟烷可减轻野生型小鼠MCAO后的神经功能缺损程度，减少脑梗死面积，抑制脑缺血后的细胞凋亡，但七氟烷预处理TREK-1基因敲除型后，则无以上作用。证实了七氟烷预处理对小鼠脑缺血后有神经保护作用，且TREK-1通道参与了该保护作用，并推测这可能与七氟烷开放TREK-1通道，使细胞膜电位超极化，细胞兴奋性降低，减少兴奋性毒性损伤，从而减少神经细胞凋亡有关。为进一步研究其作用机制提供实验基础。

[1] Codaccioni JL, Velly LJ, Moubarik C, et al. Sevoflurane preconditioning against focal cerebral ischemia: inhibition of apoptosis in the face of transient improvement of neurological outcome[J]. Anesthesiology, 2009,110(6):1271-1278.

[2] 袁建清,谢敏杰,王伟.双孔钾离子通道结构以及在鼠类中枢神经系统的表达和功能[J].神经损伤与功能重建,2010,5(1):56-59.

[3] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[4] Kitano H, Young JM, Cheng J, et al. Gender-specific response to isoflurane preconditioning in focal cerebral ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2007,27(7):1337-1386.

[5] Xing B, Chen H, Zhang M, et al. Ischemic Postconditioning inhibits apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in the rat[J]. Stroke, 2008,39(8):2362-2369.

[6] Swanson RA, Morton MT, Tsao-Wu G, et al. A semiautomated method for measuring brain infarct volume[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1990,10(2):290-293.

[7] Puyal J, Ginet V, Clarke PG. Multiple interacting cell death mechanisms in the mediation of excitotoxicity and ischemic brain damage: a challenge for neuroprotection[J]. Prog Neurobiol, 2013,105(6):24-48.

[8] Oshima T, Karasawa F, Okazaki Y, et al. Effects of sevoflurance on cerebral blood flow and cerebral metabolic rate of oxygen in human beings: a comparison with isoflurane[J]. Eur J Anaesthesiol, 2003,20(7):543-547.

[9] Sakai H, Sheng H, Yates RB, et al. Isoflurane provides long-term protection against focal cerebral ischemia in the rat[J]. Anesthesiology, 2007,106(1):92-99.

[10] Payne RS, Akca O, Roewer N, et al. Sevoflurane-induced preconditioning protects against cerebral ischemic neuronal damage in rats[J]. Brain Res, 2005,1034(1-2):147-152.

[11] Luo Y, Ma D, Ieong E, et al. Xenon and sevoflurane protect against brain injury in a neonatal asphyxia model[J]. Anesthesiology, 2008,109(5):782-789.

[12] 施宏,余琼,王海莲,等.七氟烷预处理神经保护机制的研究进展[J].国际麻醉学与复苏杂志,2011,32(1):117-120.

[13] Lee HT, Kim M, Kim N, et al. Isoflurane protects against renal ischemia and reperfusion injury and modulates leukocyte infiltration in mice[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007,293(3):F713-F722.

[14] Pape M, Engelhard K, Eberspacher E, et al. The long-term effect of sevoflurane on neuronal cell damage and expression of apoptotic factors after cerebral ischemia and reperfusion in rats[J]. Anesth Analg, 2006,103(1):173-179.

[15] Franks NP, Honore E. The TREK K2P channels and their role in general anaesthesia and neuroprotection[J]. Trends Pharmacol Sci, 2004,25(11):601-608.

[16] 袁建清,廖春英,黄樱.大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马CA1区TREK-1、GFAP表达变化[J].山东医药,2015,55(45):40-42.

[17] Wang M, Song J, Xiao W, et al. Changes in lipid-sensitive two-pore domain potassium channel TREK-1 expression and its involvement in astrogliosis following cerebral ischemia in rats[J]. J Mol Neurosci, 2012,46(2):384-392.

江西省卫生计生委科技计划项目(20165343)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.009

R743.31

A

1002-266X(2016)37-0028-03

2016-06-24)