髓母细胞瘤组织中SIRT6的表达观察

耿晓华，李明闯，程习辉

(郑州大学附属郑州中心医院，郑州 450007)



髓母细胞瘤组织中SIRT6的表达观察

耿晓华，李明闯，程习辉

(郑州大学附属郑州中心医院，郑州 450007)

目的观察髓母细胞瘤组织中沉默信息调节因子6(SIRT6)的表达变化。方法20例份髓母细胞瘤组织(肿瘤组)，20例份瘤旁正常组织(瘤旁组)，采用RT-PCR法检测两组SIRT6 mRNA，Western blotting法检测SIRT6蛋白。结果肿瘤组、瘤旁组SIRT6 mRNA相对表达量分为0.21±0.16、1.01±0.27，SIRT6蛋白相对表达量分别为0.54±0.14、1.25±0.12，两组比较，P均<0.05。结论髓母细胞瘤组织中SIRT6 mRNA、蛋白表达降低。

髓母细胞瘤；沉默信息调节因子6

髓母细胞瘤是高度恶性的神经上皮组织肿瘤，也是儿童常见的恶性肿瘤之一，其预后较差，目前发病机制仍不清楚。沉默信息调节因子6(SIRT6)属Sirtuin家族成员之一[1]，其位于细胞核内，具有去乙酰化酶和ADP-核糖转移酶活性的作用，在人和小鼠多种组织中都有表达[2]，在人类大脑中亦呈高表达状态，对神经细胞的萎缩、代谢均有影响[3]。Chen等[4]发现，SIRT6可以抑制神经胶质瘤细胞在体内的生长。目前，关于SIRT6与髓母细胞瘤关系的研究鲜有报道。本研究采取RT-PCR法和Western blotting法分别对髓母细胞瘤组织中SIRT6 mRNA、蛋白进行检测，以探讨其在髓母细胞瘤发生发展中的作用。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2012年1月～2015年7月郑州大学附属郑州中心医院收治的髓母细胞瘤患者20例，男13例，女7例；年龄5～45岁；病程1周～4个月。所有患者术前均未接受化疗、放疗及其他治疗。手术留取肿瘤组织及瘤旁组织各20例份(分别计为肿瘤组和瘤旁组)。

1.2SIRT6 mRNA检测方法采用RT-PCR法。两组分别称取50 mg组织，在液氮中研磨后移入EP管，加入1 mL TRIzol，冰浴充分匀浆，室温静5 min；4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，将上清转移到新的EP管中。每管中加入200 μL氯仿，涡旋仪剧烈涡旋30 s，冰盒放置3 min；12 000 r/min 离心15 min，取上层无色的水相；加入200 μL异丙醇，反复颠倒混匀，室温静置20 min；12 000 r /min离心10 min，保留沉淀；加入预冷的1 mL的75%乙醇，涡旋仪振荡混匀；4 ℃下以7 500 r/min 离心5 min，小心去除上清，将RNA沉淀置于超净台通风干燥处理10 min；每管中加入30 μL去离子水溶解RNA沉淀，-70 ℃冻存备用。采用M-MLV逆转录酶反转录mRNA后，进行荧光定量PCR检测，所有操作均按试剂说明书进行。

1.3SIRT6蛋白检测方法采用Western blotting法。将组织置于液氮中冷冻，后迅速放于研钵中研磨成粉末状，移入EP管中，加入总蛋白提取液，置于冰上，超声波振荡3次，每次10 s，后冰上静置10 min。置于低温高速离心机，4 ℃下以10 000 r/min离心5 min，取上清以BCA法测定蛋白浓度。加入溴酚蓝后进行变性。配制10%分离胶，取等量样品上样于聚丙烯酰胺凝胶，电泳，至溴酚蓝跑到胶底部。将聚丙烯酰胺凝胶经过转膜仪转至PVDF膜上，用封闭液封闭该PVDF膜60 min，洗膜3次，将转膜后的膜蛋白面朝下平铺于保鲜膜上的一抗液中，排除气泡，常温摇床孵育，2 h后以TBST清洗，每次10 min。酶标二抗与一抗结合，于凝胶成像系统中曝光。显色后用Image J分析软件进行分析，检测其IOD累积光密度参照值，并计算每组目的蛋白对比内参表达的相对值，以此作为目的蛋白的相对表达量。

2　结果

肿瘤组、瘤旁组SIRT6 mRNA相对表达量分为0.21±0.16、1.01±0.27，SIRT6蛋白相对表达量分别为0.54±0.14、1.25±0.12，两组比较，P均<0.05。

3　讨论

Sirtuins家族为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性的组蛋白去乙酰化酶，包含7个成员(SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7)，其分布广泛，功能复杂多样[5,6]，SIRT6属Sirtuin家族成员之一，同时具有去乙酰化酶和ADP-核糖转移酶活性作用[7]，与神经生长、肿瘤发生有关[3]。目前已经证实，SIRT6参与了包括神经胶质瘤、肝癌、乳腺癌、胰腺癌和结肠癌等[4,8,9]多种肿瘤的发生，且在不同肿瘤中发挥作用不同[10]，而关于髓母细胞瘤中SIRT6mRNA转录情况及蛋白表达情况鲜有报道。

本研究显示，肿瘤组SIRT6 mRNA、蛋白相对表达量低于瘤旁组，表明SIRT6可能参与了髓母细胞瘤的发生。从上述结果可以看出，不管是在转录水平，还是在蛋白水平，SIRT6在髓母细胞瘤中的表达明显低于瘤旁正常组织，提示SIRT6在髓母细胞瘤的发生发展中可能发挥着抑制作用。这与此前报道[4,8,11]SIRT6在肝癌、胰腺癌、神经胶质瘤中表达下调结果一致。SIRT6在肿瘤形成中发挥抑制作用的机制尚不清楚，可能是通过直接与肿瘤抑制因子、致癌蛋白相互作用，调节肿瘤发展或通过调节组蛋白的乙酰化3赖氨酸9致癌基因的启动子，通过抑制ERK1/2信号通路而抑制肿瘤细胞的增长[4,11～13]。但也有报道[10,14]，SIRT6在某些肿瘤中表达高于正常组织，如前列腺癌、子宫内膜癌。

总之，髓母细胞瘤组织中SIRT6 mRNA及蛋白表达异常，推测其在髓母细胞瘤中可能发挥抑癌作用。

[1] Gil R, Barth S, Kanfi Y, et al. SIRT6 exhibits nucleosomedependent deacetylase activity[J]. Nucleic Acids Res, 2013,41(18):8537-8545.

[2] Kanfi Y, Naiman S, Amir Q, et al. The sirtuin SIRT6 regulates lifespan in male mice[J]. Nature, 2012,483(7388):218-221.

[3] Mostoslavsky R, Chua KF, Lombard DB, et al. Genomic instability and aginglike phenotype in the absence of mammalian SIRT6[J]. Cell, 2006,124(2):315-329.

[4] Chen X, Hao B, Liu Y, et al. The histone deacetylase SIRT6 suppresses the expression of the RNA-binding protein PCBP2 in glioma[J].Biochem Biophys Res Commun, 2014,446(1):364-369.

[5] Metoyer CF, Pruitt K. The role of Sirtuin proteins in obesity[J]. Pathophysiology, 2008,15(2)103-108.

[6] Haigis MC, Guarente LP. Mammalian Sirtuins-emerging roles in physiology, aging and calorie restriction[J]. Genes Dev, 2006,20(21):2913-2921.

[7] Herskovits AZ, Guarente L. Sirtuin deacetylases in neurodegenerative diseases of aging[J]. Cell Res, 2013,23(6):746-758.

[8] Marquardt JU, Fischer K, Baus K, et al. SIRT6 dependent genetic and epigenetic alterations are associated with poor clinical outcome in HCC patients[J]. Hepatology, 2013,58(3):1054-1064.

[9] Khongkow M, Olmos Y, Gong C, et al. SIRT6 modulates paclitaxel and epirubicin resistance and survival in breast cancer[J]. Carcinogenesis, 2013,34(7):1476-1486.

[10] 赵干业,韩丽敏,童坦君.SIRT6功能与疾病研究进展[J].生理科学进展,2014,45(4):299-303.

[11] Sebastián C, Zwaans BM, Silberman DM, et al. The histone deacetylase SIRT6 is a tumor suppressor that controls cancer metabolism[J]. Cell, 2012,151(6):1185-1199.

[12] Lin Z, Yang H, Tan C, et al. USP10 antagonizes c-Myc transcriptional activation through SIRT6 stabilization to suppress tumor formation[J]. Cell Rep, 2013,5(6):1639-1649.

[13] Zhang ZG, Qin CY. Sirt6 suppresses hepatocellular carcinoma cell growth via inhibiting the extracellular signal-regulated kinase signaling pathway[J]. Mol Med Rep, 2014,9(3):882-888.

[14] Kanfi Y, Naiman S, Amir G, et al. The sirtuin SIRT6 regulates lifespan in male mice[J]. Nature, 2012,483(7388):218-221.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.015

R733.3

B

1002-266X(2016)15-0046-02

2015-11-16)