美国养禽业提高家禽产品安全性的新选择

黎先伟 译 By K. Venkitanarayanan

美国养禽业提高家禽产品安全性的新选择

黎先伟 译 By K. Venkitanarayanan

前言

在美国，肠炎沙门氏菌和空场弯曲杆菌是感染人类的2种主要的食源性致病菌，这与食用生的或未煮熟的家禽产品有很大关系。而肠炎沙门氏菌是从家禽产品中分离到的最常见的沙门氏菌血清型。另一方面，流行病学调查结果已证实，人感染空肠弯曲杆菌与食用生的或未煮熟的家禽肉之间有着显著地关系。人类每年都会因为这些病原菌感染而造成数百万美元的损失。最近的流行病学调查数据显示，在美国，沙门氏菌每年会导致约100万例非伤寒沙门氏菌感染的病例，造成19 226人住院和378人死亡，而弯曲杆菌则会导致约80万例病例，造成8 463人住院和76人死亡。

此外，据估计沙门氏菌和弯曲杆菌每年分别造成的经济损失约为44亿和15亿美元。家禽和家禽产品被认为是导致这些食源性疾病的重要来源。家禽产品是人类饮食中重要的一部分，在过去十年间家禽产品的人均消费量也在逐渐增加。因此，家禽及家禽产品的安全性是极为重要的，尤其对公众健康和经济效益有着重要的影响。

肠炎沙门氏菌和空肠弯曲杆菌的自然宿主是鸡，它们主要定殖于鸡的肠道内，而盲肠是其定殖的主要部位。一旦定殖后，病原菌会通过粪便排泄到环境中，从而有可能污染环境，尤其是在成长舍会感染健康的禽群（横向传播）。此外，在屠宰或后续的处理过程中，受病原菌感染的或受污染的胴体可交叉感染其他胴体。在胴体的机械化加工处理期间，病原菌拥有大量的机会可从鸡的表面转移到其肉上。此外，当活禽送到加工厂后，要想使胴体的病原菌数量小于其活禽外表存在的病原菌数量，是非常不容易的。而且，机械化的去除内脏会导致这些病原菌从胃肠道中溢出，从而污染食用动物的胴体。美国农业部食品安全检验局收集了从2005年至2010年期间，肉鸡胴体冲洗后肠炎沙门氏菌的检出率情况。结果显示，每年分离菌的总量增长4倍多，而且肠炎沙门氏菌阳性菌的确诊量增加了3倍。此外，在美国，食用未煮熟的鸡肉被认为是人零星感染肠炎沙门氏菌的一个危险因素。另一方面，空肠弯曲菌在肉鸡内的定殖是非常普遍的，而且难以避免。在鸡中，空肠弯曲菌主要定殖在盲肠和小肠的黏膜上皮细胞上。岩藻糖（L-Fucose），是鸡盲肠粘液的粘蛋白中最主要的碳水化合物，可被空肠弯曲菌利用作为其生长的唯一底物。

因此，鸡盲肠的环境是非常有利于空肠弯曲菌的生存和繁殖，并且是禽类空肠弯曲菌主要的定殖场所。除了家禽肉，受沙门氏菌污染的鸡蛋也潜在的对公众健康构成重大的威胁。这些病原菌可能是通过逆行传播（从泄殖腔传染到输卵管）或经卵传播（从卵巢、卵泡或输卵管传染给鸡蛋）而感染鸡蛋。研究报告显示，美国在1985年至1999年期间，已知病原的沙门氏菌疫情都是与鸡蛋有关的。

同样，已有研究结果显示，在1985年至2003年期间，经确认属于食媒感染的肠炎沙门氏菌病例中，79%与鸡蛋有关或含有鸡蛋的成分。另一项研究报告发现，在美国，据估计发生了70万例鸡蛋源性沙门氏菌感染的病例，占总食源性沙门氏菌病例的47%，每年造成的经济损失超过10亿美元。然而，美国食品安全检验局公布的一项调查研究表明，2000年在美国由于食用受肠炎沙门氏菌污染的鸡蛋共造成182 060例病例。此外，一些流行病学调研结果已证实，沙门氏菌与食用鸡蛋之间确实存在一定的关联。2010年，美国共暴发3 578例与食用鸡蛋有关的肠炎沙门氏菌病例。鉴于人类沙门氏菌与食用鸡蛋之间存在关联，2009年美国食品药品管理局（FDA）宣布，鸡蛋构成了肠炎沙门氏菌感染的一个重要来源，同时颁布了一项法案，要求鸡蛋生产商积极采取措施，以防止肠炎沙门氏菌污染养殖场内的鸡蛋，并预防在储存和运输过程中进一步的污染。

沙门氏菌和弯曲杆菌的控制策略

由于人食用受污染的鸡肉或鸡蛋会感染肠炎沙门氏菌或空肠弯曲菌，因此减少这些病原菌在鸡肠道内的定殖，降低家禽产品受污染的水平是至关重要的。相关研究已鉴定出，防止或减少肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌在养殖场内鸡群中定殖的几个关键控制点。其中，最重要的关键控制点是，确保转移入生长舍的小鸡是无病原菌感染的。此外，受污染的饲料、垫料、水、啮齿动物和昆虫在肠炎沙门氏菌的传播过程中也发挥着重要的作用。同样的，转移受感染的家禽，以及受污染的设备、饲料车和服务人员的走动也能够促进病原菌在不同群体之间的传播。英国一项对肉鸡空肠弯曲菌来源的研究发现，养殖场内的饲料、水和空气中均存在病原菌。此外，弯曲杆菌可在肉鸡舍下游多达30m处的空气中检测到，这尤为凸显出了空气传播在病原菌的传播过程中的潜在作用。除了饮水、饲料、空气和带菌鸡群，苍蝇、野鸟和啮齿动物也是空肠弯曲菌重要的来源。由于肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌的传染源多种多样，因此在养殖场或生产基地内必须实施严格的生物安全措施，以减少这些病原菌的传播。

防控家禽肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌的一种主要策略是屠宰前处理。这种干预的目的旨在减少病原菌在鸡体内的定殖。降低肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌在鸡肠道内的数量，以减少禽肉和鸡蛋的污染。科研人员已探索出一系列减少上述两种致病菌在鸡体内定殖的措施，但成功程度各有不同。这些措施包括给小鸡喂食具有竞争性作用的排斥菌、益生菌、噬菌体、甘露寡糖、低聚果糖、菊苣果聚糖、有机酸如乙酸、丙酸和甲酸、单宁酸和抗生素及其他抗菌药物。此外，科研人员已经开始进行一些疫苗接种措施的研究，以控制鸡肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌。尽管采取了严格的预防控制方案，但是美国疾病预防控制中心的报告显示，美国经实验室确诊的沙门氏菌病例增加了3%（美国疾病预防控制中心，2012），这强调有必要采取一些替代的策略以控制这种食源性致病菌。

在解决这个问题的过程中，我们一直在调查研究一些植物分子对控制肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌的潜能。以下是评估几种植物分子的抗菌功效所进行的研究，旨在提高家禽产品的安全性。

辛酸对肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌的作用

辛酸是一种天然的，存在于椰子油、棕榈仁油、山羊奶和牛奶中的（含8个碳原子）中链脂肪酸，并被美国食品药品管理局（FDA）批准为“通常视为安全的”（GRAS）食品级化学物质。我们首份报告的研究内容之一是，在迅速降低鸡盲肠内容物的肠炎沙门氏菌（＞5.0 log cfu）方面，辛酸的体外抗菌潜能。有趣的是，辛酸可最低程度地抑制盲肠内源性厌氧菌的数量（P＜0.05）。此外，Van Immerseel和coworkers的研究结果已证实，中链脂肪酸（MCFA），特别是在小鸡饲料中补充辛酸（3 g/kg饲料），可显著地减少肠炎沙门氏菌在禽类的盲肠和内脏中定殖。他们发现，MCFA可抑制hilA的表达水平，而其是参与沙门氏菌入侵过程的一个关键的基因调控子，这可导致沙门氏菌在体内的定殖数量减少。而且，一些对猪群的研究结果表明，膳食中的辛酸在胃和小肠内达到杀菌浓度，可明显地减少肠道的细菌负荷，且对生长性能无任何不良影响。

基于先前的研究数据证实，辛酸对肠炎沙门氏菌的体外抗菌效果，我们又进行了一项研究，以确定辛酸控制上市肉鸡病原菌的预防性潜能。在鸡群的饲料中补充0.7%或1%的辛酸，连续饲喂18日。结果显示，在攻毒后第7天至第10天，饲料中补充0.7%和1%辛酸可持续减少鸡群的盲肠、泄殖腔、肝、脾和小肠中肠炎沙门氏菌的数量（P＜0.05）。而试验组和对照组试验鸡群之间，采食量和体重均没有显著的差异。组织学检查结果显示，补充辛酸后，鸡群的盲肠和肝脏并没有发现明显的病理变化。此外，补充辛酸并没有显著的影响盲肠的PH或盲肠的内源性细菌。总的来说，饲料中预防性补充辛酸可能会减少鸡肠炎沙门氏菌的定殖，且无不良的影响。

在预防性补充辛酸的研究基础上，我们确定了辛酸对减少鸡肠炎沙门氏菌的治疗效果。在屠宰前5天，于3周龄或6周龄鸡群的饲料中补充0.7%或1%的辛酸。与预防性补充试验所得出的结果相似，补充0.7%或1%的辛酸均可显著地减少两组试验鸡群的盲肠、小肠、泄殖腔、肝和脾中肠炎沙门氏菌的数量（P＜0.05）。此外，试验组和对照组试验鸡群之间，采食量和体重均没有明显的差异（P＞0.05）。总而言之，研究结果证实，辛酸有可能作为一种潜在的抗菌饲料添加剂，用于减少肉鸡肠炎沙门氏菌的定殖。

此外，为了阐明辛酸对肠炎沙门氏菌的潜在抗菌机制，我们调查研究，辛酸的亚抑菌浓度（SIC；不能抑制细菌生长的低于最小抑菌浓度的最高浓度）是否可减少肠炎沙门氏菌侵袭虎皮鹦鹉腹部肿瘤细胞（BATC），禽小肠上皮细胞株，以及降低沙门氏菌侵袭基因，hilA和hilD的表达。结果显示，辛酸可降低肠炎沙门氏菌菌株80%的侵袭能力（P＜0.05）。而且基因表达的研究结果证实，辛酸可下调沙门氏菌侵袭基因hilA和hilD的表达（P＜0.05）。

这些研究结果表明，补充辛酸可能是通过下调关键侵袭基因，hilA和hilD的表达而降低病原菌侵袭小肠上皮细胞的能力。这些结果与Van Immerseel等人在2004年的研究结果相一致。他们发现，中链脂肪酸（MCFA）可抑制hilA的表达，从而降低鸡体内沙门氏菌的定殖。这些研究人员认为，中链脂肪酸（MCFA）有可能会减少沙门氏菌侵袭T-84上皮细胞株的能力。此外，相关研究表明，2 mmol的辛酸可降低鼠伤寒沙门氏菌侵袭猪上皮细胞的能力，以及下调细菌hilA和 hilD基因的表达。

除了这些研究以外，美国费耶特维尔的阿肯色州大学也开展了一系列调查研究，以确定辛酸对影响肉鸡空肠弯曲菌定殖的潜能。在一项研究中，于1日龄雏鸡的饲料中补充辛酸。研究结果显示，补充0.7%的辛酸可减少空肠弯曲菌的定殖。而且，相关研究还探讨了在15日龄的雏鸡剖检前72小时补充辛酸，以确定其对空肠弯曲菌的治疗潜能。结果发现，补充0.7%和1.4%的辛酸可使盲肠的空肠弯曲菌数减少3 至5 log10 cfu/g。此外，研究证实，辛酸也可降低大龄鸡盲肠的弯曲杆菌数量。Solis de los Santos等人研究发现，在试验的最后3天或7天补充0.7%的辛酸，可持续地降低上市（42日龄）肉鸡空肠弯曲菌的定殖，且无任何不良影响。有意思的是，当在试验的最后3天补充0.7%的辛酸，即使是在12小时的停药期之后，空肠弯曲菌的定殖量也会减少3 log10 cfu/g。

这些研究结果共同表明，当饲料中补充浓度为0.7%的辛酸时，可预防性和治疗性地降低商品肉鸡空肠弯曲杆菌的定殖，而且还可在休药期间用于减少机体病原菌的携带量。

植物酚类物质对肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌的作用

植物精油是一类常被作为膳食成分的天然分子，尤其是用于保存食物和增强食品的风味。过往的研究已证实了一些植物精油的抗菌性能，而且也验证了这些精油的各种活性成分。这些化合物有助于植物作为一种防御机制，以抵抗入侵的微生物和捕食者。虽然目前对香精油的抗菌性能有大量的数据，但大多数的研究都是采用标准肉汤系统进行的体外抗菌活性的研究，尤为强调提高食品安全所采取的的具体应用措施需经过确认和验证。

基于体外筛选一些对沙门氏菌和弯曲杆菌具有抗菌活性的植物抗菌素（PDA），我们发现4种分子，分别是反式肉桂醛、丁香酚、香芹酚和百里香酚，在控制家禽的这些病原菌方面具有潜在用途。下文则主要对此进行探讨。

反式肉桂醛，肉桂树皮中提取的一种主要成分，是获得美国食品药品管理局（FDA）批准的，可用于食品中的一种GRAS化合物。美国香料萃取物生产者协会（FEMA）的报告称，从亚慢性和慢性研究肠道的结果来看，反式肉桂醛在保守预估的摄入量和没有观察到毒副作用的水平之间，具有广泛的安全性。该报告还指出，该化合物不具有遗传毒性和致突变作用。此外，Michiels等人的研究显示，给仔猪口服补充13.0 mg/kg体重的反式肉桂醛，并不会导致其产生任何的毒性作用。

而且，来自我们实验室公布的数据表明，在体外试验中，分别补充0.5%和1.5%的反式肉桂醛不会对人上皮细胞株和尿路细胞产生任何细胞毒性作用。反式肉桂醛对许多种不同的食源性病原性致病菌，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有抗菌活性。已有的研究结果证实，反式肉桂醛对肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7具有抗菌活性。在另一项研究中，结果发现，反式肉桂醛在体外试验中可抑制猪体内的多种病原菌，且不会对自然菌群产生任何有害影响。研究还发现，该化合物可在体外抑制鼠伤寒沙门氏菌DT104、大肠杆菌O157：H7、和其大肠菌群的活性，而有益菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的活性几乎没有受到抑制。

丁香酚是一种天然的分子，属于丁香油中的一种有效成分。许多学者已证实了丁香油及丁香酚的抗菌活性。Si等人的研究结果显示，在猪的体外模型中，丁香酚可抑制多种致病菌的活性，且不会产生任何有害影响。与反式肉桂醛相似，丁香酚也可降低鼠伤寒沙门氏菌DT104、大肠杆菌O157：H7和其他大肠菌群的活性，而对乳酸杆菌和双歧杆菌无明显地抑制作用（Si 等，2006）。在另一项研究中，Michiels等人研究发现，给仔猪补充剂量为12.5 mg/kg体重的丁香酚不会对机体造成任何毒副作用。

香芹酚和百里香酚是从腺毛牛至中提取的牛至精油的主要成分。这种精油已被证实可有效地对抗胃肠道和泌尿生殖道的细菌和真菌感染。

在这些研究报告的基础上，我们进行了一系列的试验，包括采用体外模型研究这些植物分子的抗沙门氏菌和抗弯曲杆菌的潜能。我们主要采用的是盲肠内容物，因为与人工合成的实验媒介相比，这种溶媒更接近鸡盲肠的内环境。我们观察到在所有植物抗菌素（PDA）的测试中，反式肉桂醛在减少盲肠内容物的肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌方面具有最显著的效果，而且不会影响整体盲肠内源性菌群的数量。与空白对照组相比，补充0.2%和0.35%的反式肉桂醛可在培养24小时后使肠炎沙门氏菌灭活9 log 10 cfu/mL。虽然与反式肉桂醛相比表现出稍微较低的抗菌潜力，但补充0.75%和1%的其他分子，如丁香酚、香芹酚和百里香酚也可在24小时的培养期后使病原菌的数量显著地减少。研究还发现，空肠弯曲菌对所有的植物抗菌素都更加敏感。例如，补充0.1%的植物抗菌素可在培养24小时后可显著地减少病原菌的数量。

空肠弯曲菌常被认为是一种难以培养的脆弱的细菌，尤其是当其离开宿主的时候，这从而解释了植物分子为什么对其敏感性会增加。饮水是鸡肠炎沙门氏菌的主要来源。被感染鸡的饲料和粪便所污染的水有可能会导致病原菌在鸡体内定殖。为了确定反式肉桂醛对减少及饮水中肠炎沙门氏菌的效果，我们进行了一项研究，采用从康涅狄格大学家禽养殖场收集到的自来水分别加入或不加入受污染的粪便（浓度为1%）或饲料（浓度为1%）。结果发现，补充0.06%的反式肉桂醛可在12.5℃和25℃含有1%粪便的水中24小时后完全灭活肠炎沙门氏菌。结果表明，反式肉桂醛对杀死饮水中鸡肠炎沙门氏菌是有效的，并有可能作为一种添加剂，以控制水源性肠炎沙门氏菌在鸡群内的定殖。

在对植物分子的体外抗菌潜能进行了探究之后，相关研究开始评估植物分子对减少肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌在鸡肠道内定殖的功效。一项研究检测了反式肉桂醛和丁香酚对上市日龄肉鸡肠炎沙门氏菌的预防效果。于家禽饲料中分别补充0.5%或0.75%的反式肉桂醛和0.75%或1%的丁香酚，连续饲喂20天。结果显示，补充0.5%和0.75%的反式肉桂醛，以及补充1%的丁香酚可在感染10天后，鸡群盲肠内沙门氏菌的减少量大于3 log 10 cfu/g（P＞0.05）。而且该化合物既不会改变PH值，也不会影响内源性盲肠菌群的数量（P＞0.05）。反式肉桂醛补充组与对照组试验鸡群相比，采食量和体重均没有明显的差异（P＞0.05）。然而，丁香酚补充组与对照组试验鸡群相比，体重却出现显著地降低（P＜0.05）。

在后续的研究中，对上市日龄肉鸡进行了两项试验研究，以确定反式肉桂醛和丁香酚对鸡肠炎沙门氏菌的治疗效果。在肉鸡上市屠宰前5天，于其饲料中补充0.75%的反式肉桂醛和1%的丁香酚作为一种抗菌添加剂。结果发现，两项试验的2种分子均能持续显著地降低肠炎沙门氏菌的数量（P＜0.05）。植物分子可使盲肠内肠炎沙门氏菌的定殖减少1.5 log 10 cfu/g（P＜0.05）。 而 反式肉桂醛和丁香酚可分别使泄殖腔内肠炎沙门氏菌的数量减少1.5 log 10 和2 log10 cfu/g（P ＜ 0.05）。

此外，为了确定植物抗菌素（PDA）对减少肉鸡肠炎沙门氏菌定殖的功效，目前我们实验室正在研究这些分子降低蛋鸡内的病原菌垂直传播给鸡蛋的潜能。初步结果表明，这些分子可有效地减少病原菌的垂直传播。此外，植物抗菌素可减少肠炎沙门氏菌粘附和侵袭鸡输卵管上皮细胞，以及下调决定输卵管定殖水平的关键基因的表达。

相关研究还检测了植物化合物香芹酚和百里香酚对减少肉鸡空肠弯曲菌数的功效。在最近的一份报告中得出的结论是，这些分子可减少空肠弯曲菌的定殖，但仍需进行更多的研究，以确保制定出一致的治疗方案。补充0.25%和1%的百里香酚、1%的香芹酚或0.5%的分子混合物均可有效地抑制肉鸡空肠弯曲菌的定殖，但其效果并不一致。在另一项研究中，Hermans等人采用排毒雏鸡模型，研究了肉桂醛对减少空肠弯曲菌KC40的功效。结果显示，饲料中含有0.3%（包囊型）的肉桂醛，不能显著地减少病原菌的数量。

香精油或其成分的一个关键特性是它们的疏水性，有助于其针对含脂的细菌细胞膜。这使得这些膜更具有渗透性，从而导致离子和其他细胞内容物的流失、。除了对细胞膜的功效，反式肉桂醛也被认为可通过抑制能量生成和葡萄糖摄取而杀灭细菌。此外，反式肉桂醛和丁香酚杀灭微生物的另一种机制是通过抑制一些关键酶的活性，如氨基酸脱羧酶来实现的。由于植物分子中含有一些化学基团的结构，因此其抗菌活性归因于多种特异的作用机制。所以，我们假设细菌对植物抗菌剂产生耐药性的潜能是可以忽略的。

为了确定殖物分子对细菌致病机制的潜在影响，我们调查研究，反式肉桂醛和丁香酚能否减少肠炎沙门氏菌侵袭虎皮鹦鹉腹部肿瘤细胞的能力（BATC）。结果显示，反式肉桂醛和丁香酚可降低肠炎沙门氏菌的侵袭能力，并可下调侵袭基因hilA、hilD和invF，以及运动性基因、flhC和motA的表达（P＜0.05）。而且，这些分子可显著地降低病原菌的运动性（P＜0.05）。

鉴于反式肉桂醛和丁香酚能够降低病原菌的侵袭力和运动性，我们从暴露于亚抑菌浓度植物分子内的肠炎沙门氏菌中提取RNA进行微列阵研究，以阐明反式肉桂醛或丁香酚下调基因的可能途径。细菌接触一种抑制剂的表达谱分析可对基因通路的特性给予新的信息，并可研究抑制剂的作用机制。我们微列阵的数据显示，这些分子可下调肠炎沙门氏菌在厌氧条件下，调控沙门氏菌毒力岛、3型分泌系统、外膜蛋白、代谢途径和电子受体等基因的表达。目前，我们正在调查研究亚抑菌浓度的植物抗菌素对空肠弯曲菌全基因组的反应。

结论

虽然在食品安全中通过实施病原菌控制计划已取得了实质性的进展，但是肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌仍然是家禽产品最常见的可传染给人类的食源性病原菌。因此，创新型的农场策略以防止这些病原菌在家禽中定殖，对减少或预防家禽产品的污染来说是至关重要的。在饲料或饮水添加抗菌药物的治疗措施是养殖户所能接受的最实用且最经济可行的方法。而且，天然安全的抗菌药因具有无毒性的特点，将会更受养殖生产者，包括有机农产品生产者的青睐。总而言之，我们的研究表明，辛酸、反式肉桂醛、丁香酚、香芹酚作为膳食补充剂，以减少鸡肠炎沙门氏菌和空肠弯曲菌的数量。此外，微列阵数据显示，这些分子可能会通过抑制细菌的毒力和定殖的机制来减少病原菌的数量。