结直肠癌患者外周血LAP+CD4+调节性T细胞的分离纯化及功能鉴定

阳祖庆,江志远,钟武,王时俊,曹云飞

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)



结直肠癌患者外周血LAP+CD4+调节性T细胞的分离纯化及功能鉴定

阳祖庆,江志远,钟武,王时俊,曹云飞

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的 应用免疫磁珠分选法分离纯化结直肠癌患者外周血中LAP+CD4+调节性T细胞(LAP+CD4+T)，并对分选获得的目的细胞进行体外功能的初步研究。方法 按照免疫磁珠两步法(阴性分选和阳性分选)分离结直肠癌患者外周血单个核细胞中的LAP+CD4+T细胞，流式细胞术(FACS)检测分选后细胞的纯度；台盼蓝染色检测细胞存活率；CCK-8掺入法检测其对LAP-CD4+T细胞的增殖抑制效应；ELISA法检测体外细胞因子TGF-β和IL-10表达。结果 经免疫磁珠法分选获得的LAP+CD4+T细胞纯度为(95.16±2.11)%，台盼蓝染色细胞存活率为(93.64±1.33)%。CCK-8掺入法检测结果显示LAP+CD4+T细胞干预后LAP-CD4+T细胞生长明显受到抑制(P=0.000)；ELISA结果显示LAP+CD4+T细胞较LAP-CD4+T细胞分泌更高浓度的细胞抑制因子TGF-β和IL-10(P=0.000)。结论 免疫磁珠法分选结直肠患者外周血中LAP+CD4+T细胞具有高效、快捷、纯度高等优点，且不损伤细胞活性。

结直肠癌；免疫磁珠法；LAP+CD4+调节性T细胞

结直肠癌(CRC)是胃肠道疾病中常见的恶性肿瘤，美国国家癌症协会2014年最新数据显示，CRC的发病率和病死率排在常见致死性恶性肿瘤疾病的第三位[1]。目前我国CRC病死率排在恶性肿瘤死亡疾病的第五位[2]。CRC的恶性增殖与机体免疫功能下降及肿瘤细胞的免疫逃逸分不开[3,4]。已有研究结果显示调节性T淋巴细胞可富集到胃癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤患者的外周血及其肿瘤组织中，提示其可能参与胃癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞的免疫逃逸[3～5]，并且在肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。LAP+CD4+调节性T细胞(LAP+CD4+T)是新近发现不同于传统调节性T细胞的新型CD4+T细胞亚群，体内外实验[6]证实其与多种自身免疫性疾病的发生、发展及预后相关，且较传统调节性T细胞有更强的免疫抑制功能，但其在CRC中的发病机制尚不明确。因此如何从CRC患者外周血中简便、快速分离出高纯度LAP+CD4+T细胞，对今后研究LAP+CD4+T细胞将有重要意义。本研究旨在探索一种能用于体外分离和纯化CRC患者外周血LAP+CD4+T细胞的方法，为LAP+CD4+T细胞在CRC临床及基础研究中提供帮助。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年6月～2015年1月广西医科大学附属第一医院结直肠肛门外科新入院经病理诊断为CRC患者27例，男11例、女16例，年龄32～70岁，平均52岁。患者术前均未接受任何化学或放射治疗及免疫治疗，且术前检查均排除自身免疫性及感染性疾病。本研究均符合人体实验伦理学标准，获本院伦理委员会批准及所有受试者本人同意。

1.2 单个核细胞悬液的制备 抽取患者新鲜外周血6 mL并缓慢加入装有6 mL Ficoll-hypaque淋巴细胞分离液的15 mL无菌离心管中，2 500 r/min，离心30 min，吸取中间云雾状细胞，即为外周血单个核细胞(PBMC)，用经高压灭菌的PBS液洗涤2次，再以含1%胎牛血清(PBS)液重悬细胞，调整浓度至5×107/mL，至少取1 mL细胞悬液置于10 mL无菌离心管中用于磁珠分选实验。

1.3 磁珠阴性CD4+T细胞分选 将单个核细胞悬液按1×105/mL 比例放于5 mL的聚乙烯试管中。按50 μL/mL 加入 Easysep Human CD4+T Cell enrichment cocktail混匀，室温(15～25 ℃)孵育10 min。再加入含抗生物素标记的磁珠混匀后避光室温孵育10 min。Buffer洗涤后1 500 r/min，离心5 min弃上清液，沉淀用1 mL Buffer重悬。将MS柱置于MACS分选系统中MPC架上，用2 mL Buffer过柱，然后将细胞悬液加入柱内，再用1 mL Buffer洗柱并收集从分选柱中流出的细胞。取少量细胞加入抗CD4-FITC标记的抗体，用流式细胞仪分析CD4+T 细胞的纯度。

1.4 磁珠阳性LAP+CD4+T细胞分选 将CD4+T细胞悬液调整至0.5×105/mL，900 μL Buffer重悬，加入100 μL Easysep Positive selection cocktail室温孵育15 min，再加入50 μL Easysep SA 磁性微粒避光室温孵育15 min。将MS柱置于MACS分选系统中MPC架上，1 mL Buffer过柱，然后将重悬的细胞液加入柱内，用1 mL Buffer洗柱，收获流下来的液体即为LAP-CD4+T细胞，然后将MS柱移开磁场放入一个无菌收集管中，快速向柱中加入1 mL Buffer并用活塞将磁珠标记的LAP+CD4+T细胞冲出柱子。Buffer洗涤2次，沉淀用1 mL Buffer重悬，分别取少量细胞悬液加入抗LAP-PE标记(LAP)潜肽相关多肽的抗体后用流式细胞仪分析 LAP+CD4+T细胞及LAP-CD4+T细胞的纯度。另外分别留取LAP+CD4+T细胞和LAP-CD4+T细胞进行增殖抑制试验。

1.5 LAP+CD4+T细胞活性和抑制功能的鉴定 取15 μL细胞悬液用4 g/L的台盼蓝染料进行染色，按照细胞存活率=染色阴性细胞数/细胞总数×100%，观察并计算细胞存活率。分别选取阳性分选的LAP+CD4+T细胞和阳性分选时收集的LAP-CD4+T细胞各0.5×105，按1∶1比例共同培养于经人CD3、CD28单抗包被的96孔板中，另外设置两个对照组(即LAP+CD4+T细胞、LAP-CD4+T细胞单独培养)，并设置复孔，每孔添加IL-2 200 U。细胞培养于5% CO2、37 ℃恒温箱中48 h，在培养结束前3 h每孔加入CCK-8 10 μL，在酶标仪450 nm波长处检测并记录每孔细胞的OD值，绘制细胞增殖曲线。

1.6 细胞因子的初步检测 分别取单独培养48 h后的LAP+CD4+T细胞和LAP-CD4+T细胞上清液20 μL，应用ELISA试剂盒按照操作说明检测细胞因子TGF-β、IL-10含量，并根据Curve Exper软件所制作出来的标准曲线计算相应的细胞因子浓度。

1.7 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，不服从正态分布时采用秩和检验，方差不齐时采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫磁珠分选后的细胞纯度 经免疫磁珠阴性分选获得的CD4+T细胞的纯度为(93.57±1.87)%，阳性分选后LAP+CD4+T细胞的纯度为(95.16±2.11)%，LAP-CD4+T细胞纯度为(96.33±2.28)%。见图1。免疫磁珠分选技术可获得较高纯度的目的细胞，可用于下一步功能鉴定实验。

2.2 免疫磁珠分选的细胞活性CD4+T细胞分选前的细胞活性为(95.28±1.17)%，经免疫磁珠两步法分选后获得的LAP+CD4+T细胞活性为(93.64±1.33)%，二者比较差异无统计学意义(t=-3.021，P=0.172)。LAP-CD4+T细胞活性为(94.05±1.41)%，与分选前的CD4+T细胞活性相比差异无统计学意义(t=-1.339，P=0.189)。台盼蓝染色实验结果提示细胞在分选前后均保持良好的活性，免疫磁珠分选过程不影响细胞的活性。

2.3 细胞培养结果LAP+CD4+T细胞单独培养OD值为0.35±0.14，LAP-CD4+T细胞单独培养OD值为0.79±0.22，两者相比差异有统计学意义(t=-7.631，P=0.000)；提示LAP+CD4+T细胞具有免疫无反应性。与LAP+CD4+T细胞单独培养相比，混合培养OD值为0.39±0.18，二者比较差异有统计学意义(t=-7.914，P=0.000)；提示LAP+CD4+T细胞对LAP-CD4+T细胞有明显抑制作用。

2.4LAP+CD4+T细胞因子IL-10和TGF-β表达比较ELISA检测结果显示LAP+CD4+T细胞高表达免疫抑制细胞因子，IL-10和TGF-β分别为(149.32±22.68)、(182.22±63.44)ng/mL，LAP-CD4+T细胞高表达免疫抑制细胞因子，IL-10和TGF-β分别为(78.52±22.38)、(113.83±29.96)ng/mL，二者同一指标比较，P均<0.05。

3 讨论

潜在性相关多肽[7]是一种能与TGF-β非共价结合的前肽，其结合于TGF-β的氨基末端并形成小的潜在TGF-β复合物。目前在小鼠模型及健康人体内均发现膜结合型TGF-β和分泌型TGF-β，体外研究实验[6]表明Treg细胞的分化及免疫抑制功能与TGF-β紧密相关。2010年Grandhi等[8]发现在健康人外周血中存在LAP+CD4+Treg细胞，这些细胞具有低增殖性且缺乏Foxp3，能分泌IL-8、IL-9、IL-10及干扰素-γ，其免疫抑制活性依赖TGF-β和IL-10。IL-10是一种重要的抗炎因子，能分泌跨膜受体复合物，调节多种免疫细胞的功能活性,进而减少炎性介质的释放，抑制炎性细胞的增殖和迁移进而缓解急慢性炎症症状[12]。最近研究[9,10]表明，IL-10能不同程度地抑制CD4+T细胞增殖及细胞因子合成，且与多种肿瘤的预后相关。TGF-β对细胞的生长分化及机体免疫功能的调节均有重要作用，可能通过以下机制促进肿瘤生长：一方面TGF-β能抑制中性粒细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞等免疫性细胞因子的产生从而抑制免疫细胞的增殖、分化及其活化[11]；另一方面TGF-β通过激活丝裂原活化蛋白激酶通路(MAPK)促进肿瘤内血管的生成继而促进肿瘤在体内的生长[12]。

LAP+CD4+T细胞作为一种新近发现的Treg细胞亚群在疾病中的作用受到越来越多的关注。现有研究[13,14]证明，LAP+CD4+T细胞能缓解红斑狼疮、糖尿病等自身炎性疾病动物模型的症状。Mahalingam等[15]研究发现CRC患者肿瘤组织中LAP+CD4+T细胞明显高于癌旁组织；该细胞易于富集到肿瘤组织中，可能参与了这里的免疫逃逸机制。这些细胞能高表达INF-γ、IL-17，相对低水平的IL-2及IL-10；对LAP-CD4+T细胞的抑制作用部分依赖TGF-β。因此想要进一步揭示LAP+CD4+T细胞功能在自身免疫性疾病和肿瘤免疫机制中的作用，就需得到一群纯度高、活力好的LAP+CD4+T细胞来研究。现今，分离LAP+CD4+T细胞主要方式有流式细胞分选法和免疫磁珠分选法，流式细胞分选法由于对实验仪器设备要求高且操作复杂成本较高，不适合广泛推广。而基于免疫吸附原理的免疫磁珠分选法具有高效、快速、操作简单的优点，短时间内能获取高纯度的LAP+CD4+T细胞。本实验采用免疫磁珠法从结直肠癌患者外周血中分离出来的CD4+T细胞纯度为(95.16±2.11)%，LAP-CD4+T细胞纯度为(96.33±2.28)%，台盼蓝染色实验显示分选后细胞活性较分选前细胞活性差异无统计学意义。说明免疫磁珠法分离LAP+CD4+T细胞对细胞活性影响很小，能满足下一步实验研究需要。ELISA实验结果显示，LAP+CD4+T细胞与LAP-CD4+T细胞比较，前者分泌较多TGF-β和IL-10，此与Grandhi等[8]有关LAP+CD4+T细胞的体外细胞因子谱的表达结果相似；说明LAP+CD4+T细胞有可能通过分泌大量免疫抑制因子继而抑制宿主对肿瘤的免疫应答，另外LAP+CD4+T细胞单独培养OD值明显低于LAP-CD4+T细胞单独培养，差异有统计学意义；说明LAP+CD4+T细胞具有较低的免疫反应性；混合培养OD值相较于LAP+CD4+T细胞单独培养的OD值差异有统计学意义；说明LAP+CD4+T细胞对LAP-CD4+T细胞有明显抑制作用，这与Mahalingam等[15]关于LAP+CD4+T细胞在结直肠癌患者肿瘤组织微环境中比例的研究结果相似，其具体机制可能与LAP+CD4+T细胞能分泌高浓度细胞免疫抑制因子TGF-β及IL-17有关，但其具体机制有待进一步研究。

综上所述，免疫磁珠法分选细胞设备简便，价格低廉，操作过程简单快速，在短时间内可获得高纯度及高存活率细胞，且无需特殊处理即可进行细胞培养、流式细胞仪分析检测等相关实验研究。因此，免疫磁珠分选技术是分选LAP+CD4+T细胞的有效方法，有良好应用前景。

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Isolation, purification and functional identification of LAP+CD4+regulatory T cells from human peripheral blood of patients with colorectal carcinoma

YANGZuqing,JIANGZhiyuan,ZHONGWu,WANGShijun,CAOYunfei

(FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore a method for isolating and purifying LAP+CD4+regulatory T (LAP+CD4+T) cells from human peripheral blood of patients with colorectal carcinoma (CRC) by magnetic activated cell sorting (MACS) and to investigate the function of these T cells in vitro. Methods LAP+CD4+T cells were isolated by MACS two-step method (negative sorting and positive sorting). The purity and the survival of these T cells were identified by flow cytometry (FACS) and Typan blue staining. The inhibition effect of LAP+CD4+T cells on the proliferation of LAP-CD4+T cells was determined by CCK-8. The expression of IL-10 and TGF-β was measured by ELISA.Results The purity of LAP+CD4+T cells isolated by MACS was 95.16%±2.11%. The cell viability was 93.64%±1.33%. The proliferation of LAP-CD4+T was obviously inhibited by intervention of LAP+CD4+T cells. The suppressor cytokine, TGF-β and IL-10, which were secreted by LAP+CD4+T cells was more than that of LAP-CD4+T cells.Conclusion MACS used for isolating LAP+CD4+T cells from peripheral blood of patients withe CRC has advantages of high efficiency, high speed, and high purity and no damage to cell activity.

colorectal carcinoma; magnetic activated cell sorting; LAP+CD4+regulatory T cells

国家自然科学基金资助项目(81250316)。

阳祖庆(1989-)，男，硕士在读，主要研究方向为结直肠癌发病机制的基础研究。E-mail：290572913@qq.com

简介：曹云飞(1971-)，男，博士，副主任医师，主要研究方向为结直肠癌发病机制的基础研究。E-mail：caoyunfei126@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.007

R735.3

A

1002-266X(2016)41-0026-04

2016-07-10)